Molekulare Grundlage für die Bindung des Integrin-Adhäsionsrezeptors an p21

Kommunikationsbiologie Band 5, Artikelnummer: 1257 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Integrin-Adhäsionsrezeptoren stellen Verbindungen zwischen extrazellulären Liganden und der zytoplasmatischen Signalübertragung her. Es wurde festgestellt, dass mehrere Kinasen direkt mit den β-Schwänzen von Integrinen interagieren, die molekulare Grundlage für diese Wechselwirkungen ist jedoch noch unbekannt. Hier untersuchen wir die Wechselwirkung zwischen der Kinasedomäne der p21-aktivierten Kinase 4 (PAK4) und dem zytoplasmatischen Schwanz von Integrin β5. Wir bestimmen drei Kristallstrukturen von PAK4-β5-Integrinkomplexen und identifizieren die PAK-Bindungsstelle. Dies ist eine Region in der membrannahen Hälfte des β5-Schwanzes und wurde durch ortsspezifische Mutagenese bestätigt. Der β5-Schwanz greift in die Kinase-Substratbindungsfurche ein und positioniert den nicht phosphorylierbaren Integrinrest Glu767 an der Phosphoakzeptorstelle. In Übereinstimmung damit wird Integrin β5 von PAK4 nur schwach phosphoryliert und hemmt entsprechend seiner Fähigkeit, die Substratbindungsstelle zu verschließen, die Kinaseaktivität schwach. Diese Ergebnisse belegen die molekulare Grundlage für β5-Integrin-PAK4-Wechselwirkungen, legen jedoch Modifikationen beim Verständnis der möglichen zellulären Rolle dieser Wechselwirkung nahe.

Integrin-Adhäsionsrezeptoren sind die Hauptvermittler der Zell-Substrat-Adhäsion und spielen eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der Zellmorphologie, -migration und -differenzierung1,2,3,4. Wichtig ist, dass diese heterodimeren Glykoproteine durch die Bindung extrazellulärer Liganden über ihre komplexen extrazellulären Multidomänenanteile und die Verbindung mit intrazellulären Signalgerüsten, Zytoskelettproteinen und Enzymen über ihre kurzen Zytoplasmaschwänze mechanische Kraft und biochemische Signale bidirektional über die Plasmamembran übertragen5,6,7 . Bei der Inside-Out-Signalisierung handelt es sich um die Wechselwirkung des zytoplasmatischen Schwanzes der Integrin-β-Untereinheit mit Proteinen, die die Affinität des Integrins für extrazelluläre Liganden erhöhen (z. B. Talin, Kindlin) oder verringern (z. B. Filamin, ICAP1)8,9; Die Werkzeuge der Strukturbiologie haben sich als zentral erwiesen, um zu verstehen, wie diese Effekte stattfinden, und um die Mechanismen der Inside-Out-Signalisierung auf molekularer Ebene zu definieren10,11,12,13,14,15. Es wurde gezeigt, dass die Signalübertragung von außen nach innen eine durch extrazelluläre Liganden ausgelöste Aktivierung intrazellulärer Signalkaskaden beinhaltet, hauptsächlich durch die Wechselwirkungen von Integrin-β-Schwänzen mit zytoplasmatischen Signalübertragungs- und Adapterproteinnetzwerken16,17. Strukturbiologische Techniken wurden verwendet, um die Mechanismen dieser Aktionen zu untersuchen, aber die Grundlage für die Signalübertragung von außen nach innen ist noch weniger gut verstanden als die Signalübertragung von innen nach außen18,19,20.

Die p21-aktivierte Kinase (PAK)-Gruppe der Serin/Threonin-Kinasen spielt eine wichtige Rolle bei der Zelladhäsion, Motilität, dem Wachstum und dem Überleben21,22,23,24. Diese Kinasen stehen funktionell unter der Kontrolle kleiner GTPasen der Rho-Familie, obwohl die molekulare Grundlage der Regulierung zwischen den Gruppen unterschiedlich ist25,26,27,28,29 und angenommen wird, dass ihre Aktivität durch andere Bindungspartner beeinflusst wird25,30,31. Zusätzlich zu ihrer Rolle als Enzyme modulieren PAKs auch die Signalübertragung, indem sie als Adapterproteine fungieren32,33. Daher wird die Funktion von PAK, ähnlich wie bei Integrinen, durch eine Reihe von Partnerproteinen beeinflusst. Bemerkenswerterweise wurden Wechselwirkungen zwischen dem zytoplasmatischen Schwanz des β5-Integrins und der PAK4-Kinasedomäne in Hefe-2-Hybrid-Assays durch Pulldown mit rekombinanten β5-Schwänzen und durch Co-Immunpräzipitation nachgewiesen34. Diese Bindung wurde mit der durch Adhäsion vermittelten Kontrolle der PAK4-Aktivität und der Zellmotilität in Verbindung gebracht35,36, mechanistische Erkenntnisse waren jedoch begrenzt, da detaillierte Informationen über die Wechselwirkung fehlten.

Die Integrinfunktion kann dadurch moduliert werden, dass ihre zytoplasmatischen Schwänze mit Proteinkinasen interagieren und von diesen phosphoryliert werden37,38. Studien zu PAK4 deuten auf eine direkte Bindung an den zytoplasmatischen Schwanz des Integrin β534 und anschließende gezielte Phosphorylierung seiner Serinreste35 hin. In ähnlicher Weise wurde gezeigt, dass die Nichtrezeptor-Tyrosinkinase Arg direkt an den zytoplasmatischen Schwanz des β1-Integrins bindet, was zu einer Arg-vermittelten Phosphorylierung des β1-Schwanz-Tyrosins führt39. Im Gegensatz dazu wurden nichtkatalytische Wechselwirkungen zwischen Integrin-β1-Schwänzen und der Pseudokinasedomäne von ILK mit der phosphorylierungsunabhängigen Kontrolle der Integrinsignalisierung in Verbindung gebracht40,41,42, was darauf hindeutet, dass eine nichtkatalytische Bindung zwischen Integrinrezeptoren und Kinasedomänen das Potenzial hat zusätzliche nichtkanonische Modi der Signalmodulation sowohl für Integrine als auch für Kinasen. Diese Beispiele stellen verschiedene potenzielle Mechanismen der Integrin-Schwanzkinase-Wechselwirkung dar, aber bisher konnten diese Wechselwirkungen nicht auf molekularer Ebene untersucht werden. Daher verwendeten wir einen strukturorientierten Ansatz, um die Wechselwirkungen des Integrin-β5-Schwanzes mit PAK4 zu untersuchen. Wir haben eine Reihe von Kristallstrukturen bestimmt und eine unerwartete Art der Interaktion zwischen Kinase und Bindungspartner beobachtet; Wir stellen fest, dass der zytoplasmatische Schwanz des Integrins β5 auf ungewöhnliche Weise in die Substratbindungsfurche von PAK4 eingreift, was keine Integrinphosphorylierung zulässt und die PAK4-Aktivität gegenüber anderen Substraten hemmt, wodurch die molekulare Grundlage dafür geklärt wird, wie PAK4 mit Integrinrezeptoren interagieren kann.

Um die Wechselwirkungen des zytoplasmatischen Integrin-β5-Schwanzes (Abb. 1a) mit PAK4 zu untersuchen, verwendeten wir gut validierte His-markierte rekombinante Modelle von Integrin-β-Schwänzen, um GFP-markiertes PAK4 aus CHO-Zelllysaten herunterzuziehen. Wir haben die Bindung der längsten PAK4-Isoform (Isoform 1) (GFP-PAK4), eines Konstrukts, das nur die Kinasedomäne kodiert (GFP-PAK4-cat, Reste 302–591), und eines Konstrukts, das die N-terminalen Regionen von PAK4 kodiert, getestet nicht die Kinasedomäne (GFP-PAK4-Δcat, Reste 1–301). Sowohl die PAK4- als auch die PAK4-Kinasedomäne voller Länge binden den β5-Schwanz, das N-terminale Konstrukt jedoch nicht (Abb. 1b). Dies steht im Einklang mit früheren Berichten, in denen die Kinasedomäne für die Bindung von Integrin β534,35 verantwortlich ist. Unsere Kontrollexperimente zeigten Spezifität, da PAK4 nicht an αIIb-Schwänze bindet (Abb. 1b) und β5-Schwänze nicht GFP allein binden (nicht gezeigt).

a Sequenz des zytoplasmatischen Schwanzes von Integrin β5. Schwarze Linien zeigen verkürzte Konstrukte an. b Pulldown überexprimierter GFP-PAK4-Konstrukte durch an Nickelkügelchen gebundene Integrin-Zytoplasmaschwänze. Nach dem Pulldown erfolgt ein Immunblotting mit Anti-GFP-Antikörpern. 3 % des eingegebenen Lysats werden in der Eingangsspur angezeigt. Die Schwanzbeladung wird durch Coomassie-Färbung beurteilt. c Kartierung der PAK4-Bindungsstelle in Integrin-β5-Schwänzen. Quantifizierung von Pulldown-Assays für die Bindung von GFP-PAK4-Δcat oder GFP-PAK4-cat an GST oder GST-β5-Verkürzungen. Fehlerbalken zeigen SEM an. d Offensichtliche Affinität der PAK4-Kinasedomäne für den zytoplasmatischen Schwanz des Integrins β5 im Vergleich zum zytoplasmatischen Schwanz des Kontrollintegrins αIIb. Die Ergebnisse von drei unabhängigen Experimenten wurden in Prism an ein Ein-Stellen-spezifisches Bindungsmodell angepasst. e Beispielisotherme für den zytoplasmatischen β5-Schwanz, titriert in die PAK4-Kinasedomäne. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um die Bindungsstelle auf Integrin β5 abzubilden, haben wir GST-Fusionskonstrukte generiert, die verschiedene Bereiche von Integrin β5 umfassen, um GFP-PAK4-cat oder GFP-PAK4-Δcat, das in ganzen Zellen exprimiert wird, herunterzufahren. Wir stellen fest, dass der GST-markierte Integrin-β5-Schwanz voller Länge (Reste 743–799) GFP-PAK4-cat bindet, jedoch nicht mit GFP-PAK4-Δcat interagiert (Abb. 1c). Wir beobachten immer noch eine Bindung mit einem Konstrukt, das sich bis zum Rest 774 erstreckt, C-terminal zum zuvor identifizierten S759ERS-Motiv35, aber Konstrukte, die weiter verkürzt wurden, sind in der Bindung stark beeinträchtigt (Abb. 1c). Als nächstes stellten wir fest, dass Integrin-β5-PAK4-Wechselwirkungen direkt sind, indem wir His-markierte β5-Schwänze an Perlen verwenden, um gereinigtes rekombinantes PAK4-cat25 herunterzuziehen. Durch unterschiedliche Konzentrationen von PAK4-cat in den Pulldowns berechnen wir einen Kd von ~1,8 ± 0,5 µM für die PAK4-cat-Wechselwirkung mit Integrin β5 (Abb. 1d). Um diese Bindung quantitativer zu bewerten, führten wir eine isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) durch. Bei der Titration des gereinigten zytoplasmatischen Integrin-β5-Schwanzes (Reste 743–799) in gereinigtes PAK4-cat beobachten wir Bindungseigenschaften von Kd von 4,95 ± 1,5 µM, N von 1,05 ± 0,35, ΔH von –8,45 ± 0,75 kJ/mol und ΔS von 73,25 ± 2,45 J/molK (Abb. 1e und Ergänzungstabelle 1). Diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass die katalytische Domäne von PAK4 in biochemischen und biophysikalischen experimentellen Umgebungen direkt mit dem zytoplasmatischen Integrin-β5-Schwanz interagiert und dass die Interaktion einige der Reste zwischen Arg763 und Tyr774 umfasst.

Um die Details der Integrin-β5-Wechselwirkung mit PAK4 auf molekularer Ebene zu verstehen, führten wir eine Röntgenkristallographie durch. Wir haben dies in zwei Phasen gemacht. Wir begannen mit der Entwicklung chimärer Konstrukte, bei denen der β5-Schwanz (Reste 743–774) über eine 12-Reste -Gly-Ser-Ser-Wiederholung kovalent an PAK4-cat gebunden ist (Abb. 2a), von der wir hofften, dass sie die Kristallisation des Integrins erleichtern würde -gebundener Komplex. Dies ergab eine Kristallform, die mit einer Auflösung von 3,5 Å gebeugt wurde (Tabelle 1) und zeigte, dass das Peptid gebunden war, uns jedoch nicht erlaubte, das Register des gebundenen Peptids zu identifizieren, also bauten wir das Peptid als Polyalaninkette auf (Abb. 2b–d). Anschließend versuchten wir, die Wechselwirkung zwischen PAK4 und Integrin β5 zu stabilisieren. Zu diesem Zweck führten wir eine Kinase-inaktivierende Punktmutation, D440N, und eine phosphomimetische Aktivierungsschleifenmutation, S474E, ein. Diese Modifikationen ermöglichten es uns, eine Kristallform zu erhalten, die mit einer Auflösung von 2,0 Å beugt (Tabelle 1). Die Elektronendichte für den Integrin-β5-Schwanz war klar und wir konnten problemlos eine Region mit sieben Resten -Ser762-Arg-Ala-Arg-Tyr-Glu-Met768- in das korrekte Register einbauen (Abb. 2e – g und ergänzende Abb. 1). ). Diese Struktur des chimären Integrins β5-Linker-PAK4-cat bietet einen ersten Einblick in die molekulare Grundlage für die Rekrutierung von Kinasen an den zytoplasmatischen Schwänzen des Integrins. Chimäre Kristallstrukturen induzieren jedoch möglicherweise Konformationszustände, die möglicherweise physiologisch nicht relevant sind. Daher haben wir unsere strukturelle Bewertung der Interaktion fortgesetzt.

a Schematische Darstellung des chimären Integrins β5-PAK4. Die Linker-Region ist eine 12-Reste -Ser-Ser-Gly- Wiederholung. b–d P63-Struktur der Integrin-β5-PAK4-Chimäre bei 3,5 Å (nicht bei PDB eingereicht). z. B. P41212-Struktur der Integrin-β5-PAK4D440N/S474E-Chimäre (PDB-ID: 7S47). Die Felder c und f zeigen Elektronendichtekarten, die durch Integrin β5 unbeeinflusst sind, d. h. vor der Hinzufügung von Integrin β5 zum Modell. Die Tafeln d und g zeigen die endgültigen verfeinerten Karten. Fobs-Fcalc-Karten mit Konturen bei +2,5σ (grün) und −2,5σ (rot). 2Fobs-Fcalc-Karten mit Konturen bei +1σ (blau) und +2σ (hellblau).

Um Bedenken hinsichtlich einer durch Chimären induzierten Kristallpackung auszuräumen, führten wir als Nächstes eine Co-Kristallographie sowohl der Wildtyp- als auch der D440N/S474E-PAK4-Kinasedomäne mit einem synthetisierten Peptid durch, das den Integrin-β5-Resten Glu760-Ser770 entspricht. Wir haben das Peptid so entworfen, dass es alle Reste umfasst, die wir in der chimären Struktur als mit PAK4 interagierend definiert haben, und auch das zuvor identifizierte SERS-Motiv enthält. Beide Kokristallisationsexperimente führten zu gut beugenden Kristallen mit einer Auflösung von 1,9 und 2,1 Å (Tabelle 1) und lieferten eine eindeutige Elektronendichte für das gebundene Integrin-β5-Peptid (ergänzende Abbildung 1), was es uns ermöglichte, das Peptid in sein korrektes Register einzubauen (Abb. 3). Für die Wildtyp-Struktur haben wir die sieben Reste umfassende Region des Integrins β5 -Ser762-Arg-Ala-Arg-Tyr-Glu-Met768- und für die D440N/S474E-Struktur die neun Reste umfassende Region des Integrins β5 -Ser762 erstellt -Arg-Ala-Arg-Tyr-Glu-Met-Ala-Ser770-.

a–c P41212-Struktur von Wildtyp-PAK4, kokristallisiert mit dem Integrin-β5-Peptid -Glu760-Arg-Ser-Arg-Ala-Arg-Tyr-Glu-Met-Ala-Ser770- (PDB-ID: 7S48). d–f P41212-Struktur von D440N/S474E PAK4, kokristallisiert mit dem Integrin-β5-Peptid -Glu760-Arg-Ser-Arg-Ala-Arg-Tyr-Glu-Met-Ala-Ser770- (PDB-ID: 7S46). Die Felder b und e zeigen Elektronendichtekarten, die durch Integrin β5 unbeeinflusst sind, d. h. vor der Hinzufügung von Integrin β5 zum Modell. Die Tafeln c und f zeigen die endgültigen verfeinerten Karten. Fobs-Fcalc-Karten mit Konturen bei +2,5σ (grün) und −2,5σ (rot). 2Fobs-Fcalc-Karten mit Konturen bei +1σ (blau) und +2σ (hellblau).

In den Kristallstrukturen befindet sich PAK4 in einem aktiven Zustand, wobei sich die Aktivierungsschleife von der katalytischen Spalte weg erstreckt und das DFG-Motiv in einer DFG-in-Orientierung vorliegt. Die Konformation von PAK4 ist den zuvor bestimmten Strukturen von PAK4 in denselben Raumgruppen sehr ähnlich25,30,46,47,48. In allen drei Strukturen wurde eine leicht interpretierbare Elektronendichte für Integrin β5 in der Substratbindungsfurche der PAK4-Kinasedomäne gefunden.

Die drei hochauflösenden Strukturen sind konformativ ähnlich und kristallisieren in derselben Kristallform. Ein Vergleich der quadratischen Mittelwertabweichungen zwischen den drei Kinasedomänen zeigt Abweichungen zwischen 0,2 und 1,1 Å über 290 Kohlenstoff-Alphas. Ebenso sind die Rückgrate der Integrinschwänze in ihrer Konformation experimentell identisch, mit RMSDs von 0,14–0,49 Å über 6 oder 7 Kohlenstoff-Alphas (Ergänzungstabellen 2 und 3). Der Vergleich dieser drei Strukturen legt nahe, dass weder die chimären noch mutationsbedingten Modifikationen von PAK4 die Gesamtkonformation seiner Wechselwirkung mit Integrin β5 signifikant verändern (Abb. 4a, b).

ein Cartoon-Diagramm von PAK4-Integrin-β5-Strukturen, die den Kinase-C-Lappen überlagert sind. b Einzelheiten zur Integrin-β5-PAK4-Wechselwirkung. Salzbrücken, angedeutet durch gestrichelte rote Linien. c Darstellung der Position von Glu767 in den D440N-Mutantenstrukturen (oben, unten). Glu767 koordiniert N440, K442 und Ser331. d Oberflächenelektrostatik von PAK4 mit gebundenem Integrin β5 in Grün. Glu767β5 befindet sich an der Stelle des Phosphoakzeptorrests. e Nahaufnahme der Überlagerung der Integrin-Bindungsstelle. In den Feldern f–h mutierte Rückstände sind angegeben. f Herunterziehen der überexprimierten GFP-markierten katalytischen PAK4-Domäne mit rekombinanten gereinigten Wildtyp- und mutierten Integrin-β5-Schwänzen, die auf Nickelkügelchen immobilisiert sind. Gebundenes Protein wurde durch Immunblotting mit Anti-GFP-Antikörpern nachgewiesen. 3 % des eingegebenen Lysats werden in der Eingabespur angezeigt. Die Schwanzbelastung wurde durch Coomassie-Färbung beurteilt. Ein repräsentatives Experiment ist im oberen Bereich dargestellt, wobei die Quantifizierung von drei unabhängigen Replikaten (normalisiert auf den Wildtyp-β5-Schwanz) unten dargestellt ist. Der mittlere ± SD-Pulldown der katalytischen Wildtyp- und mutierten PAK4-Domäne (g) und des Volllängen-PAK4 (h) mit Wildtyp-Integrin β5 wurde wie in (f) bewertet. Repräsentative Experimente werden in den oberen Feldern gezeigt und die Quantifizierung mehrerer unabhängiger Replikate, normalisiert auf das Wildtyp-PAK-Konstrukt, wird unten gezeigt. Mittelwert ± Standardabweichung (n ≥ 4). Signifikanter Unterschied zur Wildtyp-Kontrolle, berechnet in einer einfachen ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Dunnett. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Wir beobachten Unterschiede in der Bindungsart der Seitenkette des an Wildtyp-PAK4 gebundenen Integrin-β5-Rests Glu767 im Vergleich zu D440N-PAK4. Wir stellen fest, dass in den D440N-Komplexen die Elektronendichte für den Integrin-β5-Rest Glu767 deutlich sichtbar ist (Abb. 2, 3 und S1) und dass dieser Wasserstoffbrücken mit Asn440, Lys442 und Ser331 der glycinreichen Schleife verbindet (Abb. 4c). ). Im Wildtyp-Komplex beobachten wir jedoch eine schlechte Elektronendichte für Glu767 und insgesamt höhere B-Faktoren für das Peptid und Glu767. Dennoch befindet es sich, wenn auch mit geringerer Sicherheit, an einer ähnlichen Stelle wie die D440N-Strukturen, allerdings ist das DFG-Phenylalanin Phe461 gedreht, um die Bindung zu ermöglichen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Glu767 in der katalytischen Stelle sowohl des Wildtyp- als auch des D440N-Mutanten-PAK4 untergebracht ist.

Der Haupttreiber der Erkennung von Integrin β5 durch PAK4 scheinen zwei Integrin-Argininreste (Arg763β5 und Arg 765β5) zu sein, die Salzbrückenwechselwirkungen mit sauren Bereichen innerhalb des Kinase-C-Lappens eingehen (Abb. 4b, d). Weitere Van-der-Waals-Wechselwirkungen mit der Kinasedomäne werden durch die hydrophoben Seitenketten des Integrins (Ala764β5, Met768β5) hergestellt (Abb. 4b, d). Insgesamt ähnelt die Ausrichtung des an PAK4 gebundenen Integrinpeptids früheren Strukturen von PAK4 im Komplex mit Substraten47,48 und Pseudosubstraten25,30. Bei all diesen Komplexen scheinen Salzbrückenwechselwirkungen eine Hauptkomponente der Wechselwirkung zu sein.

In den Integrin-β5-PAK4-Strukturen wurde jedoch eine unerwartete Konformation für den Integrinrest Glu767β5 beobachtet. Dieser Rest befindet sich genau dort, wo sich der Phosphoakzeptorrest in den Kinase-Substrat-Strukturen befindet47,48 und erstreckt sich in Richtung der katalytischen Spalte. Es ist überraschend, eine saure Seitenkette in einer solchen Ausrichtung zu beobachten, und unseres Wissens wurde dies bisher bei Kinase-Substrat-Paaren noch nicht beobachtet, obwohl eine aktuelle Studie von CK1δ gezeigt hat, dass die Bindung eines Phosphoserinrests an der katalytischen Stelle wichtig ist Regulierung der Kinaseaktivität49. Diese Ausrichtung kommt jedoch in allen drei hochauflösenden Integrin-β5-PAK4-Strukturen vor (Abb. 4e). Diese unerwartete Komponente der PAK4-Erkennung des zytoplasmatischen Integrin-β5-Schwanzes lässt auf die Insertion eines stark elektronegativen Rests in Richtung der ATP-Spalte schließen und scheint von der ATP-analogen Einheit aufgenommen zu werden, die in allen Strukturen eine schlechte Elektronendichte aufweist, möglicherweise aufgrund einer niedrigen Elektronendichte Belegung.

Um die strukturell definierte PAK4-β5-Bindungsstelle zu validieren, erzeugten wir Mutanten sowohl in PAK4 als auch in Integrin β5 und testeten ihre Wirkung in Pull-Down-Assays. Die Einführung einer R763E-Mutation im β5-Schwanz beeinträchtigt die Bindung an PAK4-cat stark, und wir nehmen an, dass dies auf den Verlust der Salzbrücke zwischen Arg763 in β5 und Glu512 in PAK4 zurückzuführen ist. Interessanterweise beeinträchtigt die R765E-Mutation die Bindung jedoch nicht wesentlich, was darauf hindeutet, dass Arg763 für die Integrinbindung von entscheidender Bedeutung ist (Abb. 4f). Wir haben die PAK4-Reste Asp444 und Glu512 mutiert, um die Integrinbindung zu unterbrechen. Diese PAK4-Reste befinden sich in der „Substratbindungsfurche“ und es wird angenommen, dass ihre Mutation die Fähigkeit von PAK4, nachgeschaltete Substrate zu erkennen, nachteilig beeinflusst. In Pulldown-Assays sowohl mit der katalytischen Domäne von PAK4 (Abb. 4g) als auch mit PAK4 voller Länge (Abb. 4h) beobachten wir eine starke Hemmung der GFP-markierten PAK4-Katze mit D444A- und E512R-Mutation. Wir fanden einen mäßigen Effekt mit der M482K-Mutation, die zwar eine Signifikanz gegen die Kinasedomäne erreichte, jedoch nicht gegen die volle Länge, und wir fanden keinen Effekt auf die Bindung für eine nahegelegene Mutation in PAK4, Q358A. Die Wechselwirkung zwischen PAK4 und Integrin β5 scheint daher durch die Bindung von Integrin β5 an die PAK4-Substratbindungsstelle gesteuert zu werden.

Basierend auf den Kristallstrukturen und der Mutagenese scheint PAK4 Integrin β5 in einer nicht katalytisch kompetenten Konformation zu binden. Dies steht im Gegensatz zu früheren Berichten, die darauf hinweisen, dass PAK4 eine Kinase für Integrin β535 ist. Daher haben wir die Fähigkeit von PAK4 zur Phosphorylierung von Integrin β5 in unseren Händen untersucht. Wir stellen fest, dass die Kinaseaktivität gegenüber dem zytoplasmatischen Schwanz von Integrin β5 in voller Länge vernachlässigbar war und dass das Familienmitglied PAK6 ebenfalls keine starke Phosphorylierung von Integrin β5 zeigt (Abb. 5a).

Ein PAK4 phosphoryliert das Maltose-bindende Protein und autophosphoryliert sich selbst. Es zeigt jedoch kaum Hinweise auf eine robuste Phosphorylierung oder Phosphorylierung von GST und eine GST-Fusion von Integrin β5, das die Reste 743–774 umfasst. PAK4 zeigt auch kaum Hinweise auf eine robuste Phosphorylierung von GST-Integrin β3 (Reste 759–788). Zum Vergleich ist die Aktivität der katalytischen Domäne von PAK6 dargestellt. b Überlagerung von Integrin-β5-gebundenem PAK4 mit der Struktur von autoinhibitorischem Pseudosubstrat-gebundenem PAK4cat (PDB: 4FII), die zeigt, dass eine ähnliche Substratbindungsfurche besetzt ist. c Die Titration des zytoplasmatischen Schwanzes von Integrin β5 in voller Länge unterdrückt die PAK4cat-Phosphorylierung von MBP (klare Kreise), wobei Autoradiographie und Coomassie-Färbungen gezeigt werden. PS bezieht sich auf 0,05 µM Pseudosubstrat-Kontrollpeptid (RPKPLVDP)25. N = 3. Titration des 11mer-Integrin-β5-Peptids (ERSRARYEMAS) zur Hemmung der Phosphorylierung des LIMK1-10mer-Peptids (RKKRYTVVGN) in Gegenwart von 1 mg/ml BSA (schwarze Quadrate). N = 6. SD angezeigt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Wir haben zuvor gezeigt, dass die PAK4-Kinaseaktivität durch eine interne N-terminale Pseudosubstratsequenz25 gehemmt wird. Die PAK4-Pseudosubstrathemmung weist eine geringe Sequenzähnlichkeit mit β5-Schwänzen auf, wirkt jedoch auf ähnliche Weise (Abb. 5b). Wir fragten uns daher, ob die Bindung von Integrin an PAK4 die Kinaseaktivität unterdrücken könnte. Wir haben dies mithilfe von In-vitro-Kinase-Assays in Gegenwart von Integrin-β5-Schwanzpeptiden voller Länge getestet und eine Unterdrückung der katalytischen Aktivität beobachtet (Abb. 5c). Wir fanden heraus, dass ein kurzes 11mer-Integrin-β5-Peptid die Phosphorylierung eines 10mer-Peptids hemmen kann, das der Phosphorylierungsstelle innerhalb der LIM-Domänenkinase 1, LIMK1, entspricht (Abb. 5c). Die Quantifizierung der Hemmung ergibt einen IC50 von 160 ± 40 µM (Abb. 5c). Die relativ schwache Hemmung der katalytischen Aktivität durch β5-Peptide ist weniger ausgeprägt als die, die beim N-terminalen Pseudosubstratpeptid beobachtet wird50, zeigt jedoch deutlich eine Beeinträchtigung der Fähigkeit von PAK4, Substrat in Gegenwart von Integrin β5 zu phosphorylieren, was auf eine Rekrutierung von PAK4 an zytoplasmatischen Integrinschwänzen hinweist unterdrückt die PAK4-Aktivität.

Die Integrinaktivität wird durch Phosphorylierungsereignisse verändert37,38, es wird jedoch auch berichtet, dass eine Reihe von Proteinkinasen an zytoplasmatische Integrinschwänze binden, in einigen Fällen direkt über ihre Kinasedomänen34,39,51,52,53,54. In dieser Studie liefern wir Beweise auf molekularer Ebene dafür, wie eine Kinasedomäne mit einem zytoplasmatischen Integrinschwanz interagiert. In unseren Kristallstrukturen zeigen wir, dass PAK4 auf Kinase-Pseudosubstrat-ähnliche Weise an Integrin β5 rekrutiert wird, wobei das Integrin an der Kinasesubstrat-Bindungsstelle angreift und die Kinaseaktivität unterdrückt.

Wir haben vier Strukturen von PAK4 im Komplex mit Integrin β5 bestimmt. Mit unseren ersten Chimären konnten wir sowohl bestätigen, dass die Bindung in einer 3,5 Å-Lösung erfolgt, als auch das Interaktionsregister in einer Struktur definieren, die zwei PAK4-Mutationen des katalytischen Asp (D440N) und des Aktivierungsschleifenphosphosits (S474E) enthielt. Diese chimären Strukturen ließen die interessante Möglichkeit aufkommen, dass der Komplex zwischen PAK4 und Integrin β5 durch eine Kinase-Substrat-ähnliche Wechselwirkung angetrieben werden könnte. Daher haben wir anschließend zwei weitere Strukturen des Doppelmutanten PAK4 (D440N/S474E) und des Wildtyps bestimmt PAK4 im Komplex mit der Peptidsequenz, die wir aus den Chimären kartiert hatten. Die Co-Kristallisation zeigte eine nahezu identische Wechselwirkung und brachte zwei Erkenntnisse.

Erstens könnte die Pseudosubstratregulation von PAK4 ein umfassenderer Aspekt der Modulation dieser Kinasegruppe sein als bisher angenommen. Wir haben zuvor gezeigt, dass das autoinhibitorische Pseudosubstratmotiv, das sich um einen Prolinrest (Pro50) dreht, der Schlüssel zur Kinasemodulation ist25,50, und andere Gruppen haben gezeigt, dass die Bindungspartnerproteine INKA1 und INKA2 die Aktivität durch Pseudosubstratbindung modulieren30,31. Wir haben dann gezeigt, dass CDC42 über eine ausgedehnte Schnittstelle, die eine Pseudosubstrat-Inhibitionsregion enthält, an PAK4 bindet27. Die Hinzufügung der PAK4-Integrin-β5-Strukturen zu diesem Array erweitert nun die potenziellen Modulationseffekte der Kinaseaktivität weiter. Wie bei den meisten gut untersuchten PAK-Substraten24,47,48 scheint bei jeder Pseudosubstrat-Wechselwirkung die Erkennung des Substrats durch die Erkennung eines Argininrests zwei oder drei Aminosäuren N-terminal der Phosphoakzeptorposition gesteuert zu werden, und möglicherweise stellt dies eine Erkenntnis dar untersucht die Fähigkeit von Kinase-Pseudosubstrat-Komplexen, Schlüsselmerkmale von Kinase-Substrat-Paaren nachzuahmen, und zeigt, dass die Regulierung der katalytischen Aktivität durch viele Faktoren in der Zelle beeinflusst wird.

Zweitens war der Rest an der P-0-Position, der Stelle der Phosphoakzeptanz in einem kanonischen Substrat, in jeder unserer Strukturen ein Glutaminsäurerest (Integrin-β5-Rest Glu767). Diese ungewöhnliche Konformation war Teil der treibenden Kraft für uns, neben der Chimäre auch Co-Kristallstrukturen zu bestimmen. Wir waren besorgt, dass die Chimäre aufgrund ihres Ersatzes des sauren Asp440 durch Asn besser in der Lage war, eine Glutaminsäure an dieser Position unterzubringen als Wildtyp-PAK4. Unsere beiden Co-Kristalle von Wildtyp und D440N/S474E PAK4 milderten diese Bedenken, indem sie nahezu identische Integrinorientierungen und eine nahezu identische Platzierung der Glutaminsäure aufwiesen. Der Einbau eines sauren Rests in die katalytische Spalte ist ungewöhnlich, aber nicht beispiellos. Die Kinase CK1 bindet im Rahmen ihres Regulationsmechanismus fest an ein phosphoryliertes Substrat, wobei sich das Phosphoserin an der Phosphoakzeptorstelle befindet, was darauf hindeutet, dass Ankerpunkte zwischen dem gebundenen Substrat und der Kinase die elektrostatisch ungünstige Wechselwirkung erleichtern49. In ähnlicher Weise könnten die Ankerpunkte der PAK4-Integrin-β5-Wechselwirkung die Komplexbildung gegenüber der ungewöhnlichen Elektrostatik der Insertion saurer Reste in den katalytischen Spalt begünstigen.

In ähnlicher Weise wurden zuvor mehrere Strukturen des PAK4 im Komplex mit Substraten, Pseudosubstraten und Bindungspartnern bestimmt. Wesentlich für jeden dieser Komplexe ist die Wechselwirkung der Kinasedomäne über ihre Substratbindungsfurche und kurze lineare Partnermotive. Jeder der bekannten Bindungspartner enthält basisch geladene Reste, die mit den sauren Bereichen innerhalb des Kinase-C-Lappens in Kontakt treten, und ihre strukturelle Überlagerung (Abb. 6) legt nahe, dass die Salzverbrückung der Argininreste die Schlüsselrolle bei der Erkennung und Bindung spielt.

Überlagerung von PAK4-Strukturen im Komplex mit Integrin β5 (7S46, 7S47 und 7S48), Konsensuspeptid (2Q0N), PAKtide-S (4JDI)47, autoinhibitorischem Pseudosubstrat (4FII)25, N-terminaler polybasischer Region (5UPK)27, ( Inka-inhibitorisches Pseudosubstrat (4XBU)30, LIMK1-Substratpeptid (6WLY)48 und β-Catenin-Substratpeptid (6WLX)48. eine elektrostatische Oberfläche von PAKtide-S gebundenem PAK4, Stäbchen für gebundenes AMP-PNP und Peptide im Stäbchenformat für jede Struktur , wenn Kinasedomänen auf ihren C-Lappen überlagert sind. b Nahaufnahme der Peptide, die die Ähnlichkeit der Position für die basisch geladenen Argininreste veranschaulicht. Phosphoakzeptorstelle als P-0 angegeben.

Frühere Literatur deutete auf eine PAK4-Integrin-β5-Wechselwirkung hin, der Komplex führte jedoch zur Phosphorylierung von Integrin-β5 und wurde durch das Integrin-S759ERS762-Motiv vermittelt34,35. Obwohl ursprünglich angenommen wurde, dass das SERS-Motiv für die Wechselwirkung mit PAK4 wichtig ist, ist in unseren Kristallstrukturen nur das endgültige Ser762 sichtbar und befindet sich in schwacher Elektronendichte und nicht in einer für die Katalyse verfügbaren Position. Darüber hinaus sehen wir kaum Hinweise auf eine robuste Integrin-β5-Phosphorylierung durch PAK4 in vitro, stattdessen hemmt Integrin-β5 offenbar schwach die PAK4-Phosphorylierung von Substraten. Während unsere Studie die frühere Arbeit unterstützt, die eine direkte Bindung zwischen PAK4 und Integrin β5 beschreibt, legt sie nahe, dass die direkte Interaktion zwischen PAK4 und den zytoplasmatischen Schwänzen des Integrins diese unterdrücken könnte, indem sie die Einzelheiten der Vermittlung dieser Wechselwirkung aufdeckt und die Auswirkungen der Bindung auf die Katalyse bewertet Kinaseaktivität dieses wichtigen CDC42-Effektors.

Die Expression und Reinigung der katalytischen Domäne von PAK4 wurde bereits beschrieben25,27,46,47,48. Kurz gesagt, die katalytische Domäne von PAK4 (UniProt ID:O96013) wurde in einen modifizierten pET28a-Vektor (Novagen) mit N-terminalem Hexa-Histidin (6xHis)-Tag subkloniert, der durch Tobacco Etch Virus (TEV)-Protease spaltbar ist. Die Integrin-β5-Reste 743–774 nach vier Wiederholungen des Ser-Ser-Gly-Linkers wurden zur Herstellung des chimären katalytischen PAK4-Proteins verwendet. Die chimäre katalytische Domäne Integrin β5743–774-Linkerpeptide (SSGSSGSSGSSG)-PAK4 mit N-terminalem Hexa-Histidin (6xHis)-Tag, spaltbar durch Thrombin, wurde in einen pET28a-Vektor subkloniert. Doppelt mutiertes chimäres Integrin β5743–774-Linker-PAK4cat bei D440N und S474E wurde mit QuikChange (Agilent Technologies) eingeführt. Das Expressionskonstrukt für den 6xHis-markierten zytoplasmatischen β5-Schwanz wurde durch PCR erzeugt und in einen pET32-Vektor subkloniert.

Die katalytische Domäne von PAK4 wurde in der Zelle BL21-CodonPlus(DE3)RILP (Agilent Technologies) exprimiert und das chimäre Protein wurde in BL21(DE3)pLysS (Agilent Technologies) durch Induktion mit 0,5 mM Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) exprimiert. über Nacht bei 18°C. Die geernteten Pellets wurden in Lysepuffer (20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl, 1 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) und 0,1 mM Phenylmethansulfonylfluorid, PMSF) suspendiert und durch Ultraschallbehandlung lysiert. Die Überstände wurden mit einer HisTrap-Chelatsäule (GE) affinitätsgereinigt und dann über Resource Q (GE) aufgelöst. Das eluierte PAK4-cat- und chimäre Protein wurde dann auf eine Superdex 200 Improve 10/300 GL (GE)-Säule geladen (20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,15 M NaCl, 1 mM DTT). Das zytosolische 6xHis-Integrin-β5-Peptid voller Länge (Reste 743–799) wurde in Einschlusskörperchen in BL21(DE3)-Zellen (Agilent Technologies) durch Induktion mit 0,5 mM IPTG über Nacht bei 37 °C exprimiert. Nach der Zelllyse wurde das Pellet mit Waschpuffer (20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 M NaCl, 1 mM TCEP und 1 % (v/v) Triton X-100) suspendiert und der Überstand nach der Zentrifugation verworfen. 6xHis-Integrin β5743–799 wurde dann in 8 M harnstoffhaltigem Puffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1 M NaCl, 1 mM TCEP und 8 M Harnstoff) resuspendiert. Der Überstand nach der Zentrifugation wurde dann auf Ni-NTA-Agarose (Qiagen) aufgetragen, um das 6xHis-markierte Integrin-β5743–799-Peptid einzufangen. Die Rückfaltung auf der Säule wurde durch schrittweises Reduzieren der Harnstoffkonzentration im Waschpuffer durchgeführt. Anschließend wurden eluierte 6xHis-Integrin-β5743–799-Peptide und die gereinigte katalytische PAK4-Domäne gegen PBS-Puffer für ITC dialysiert.

Integrin-β5-Peptid (760-Glu-Arg-Ser-Arg-Ala-Arg-Tyr-Glu-Met-Ala-Ser-770) für die Kristallisation und LIM-Kinase-1-Peptid (503-Arg-Lys-Lys-Arg-Tyr- Thr-Val-Val-Gly-Asn-512) wurden mit N-terminalem Acetyl und C-terminalem Amid im 0,1 mM-Maßstab synthetisiert und HPLC in der Tufts University Core Facility gereinigt.

Das chimäre Integrin β5743–774-Linker-PAK4cat-Protein wurde in SEC-Puffer auf 4 mg/ml konzentriert und mit 1 mM Phosphoaminophosphonsäure-Adenylatester (AMP-PNP) und 5 mM MgCl2 inkubiert, bevor bei Raumtemperatur Kristallisationstropfen hergestellt wurden. Der Kristall des chimären Integrin-β5743–774-Linker-PAK4cat-Proteins wurde in 100 mM Natriumacetat, pH 4,0, 0,7–0,8 M Diammoniumphosphat bei Raumtemperatur kristallisiert. Die Kristalle wurden mit Reservoirpuffer und 30 % (v/v) Glycerin kryogeschützt. Aufgrund der geringen Auflösung (3,5 Å; siehe unten) haben wir uns entschieden, eine Doppelmutation bei D440N und S474E in das chimäre Protein einzuführen. Ein weiteres chimäres Integrin β5743–774-Linker-PAK4catD440N,S474E-Protein wurde mit 1 mM AMP-PNP und 5 mM MgCl2 inkubiert und dann in 0,1 M Tris-HCl (pH 8,5) und 0,5 M Trinatriumcitratpuffer bei Raumtemperatur kristallisiert . Die Kristalle wurden mit Reservoirpuffer plus 35 % (v/v) Glycerin kryogeschützt. Kristalle wurden unter Verwendung von PAK4 bei 4 mg/ml gegen 100 mM Natriumacetat, pH 4,0, 0,7–0,8 M Diammoniumphosphat bei Raumtemperatur erhalten. Gereinigte PAK4cat- und doppelt mutierte PAK4catD440N-, S474E-Proteine wurden mit 1 mM AMP-PNP und 5 mM MgCl2 vor dem Kristallisationsversuch mit 11mer Integrin β5-Peptid 760–770, gelöst in D/W, inkubiert. 2 mM Integrin-β5760–770-Peptid wurden zur Cokristallisation mit dem PAK4cat-Protein verwendet und 1 mM Peptid wurde in PAK4catD440N-, S474E-Kristalle eingeweicht. Alle Daten wurden an der Advanced Photon Source (APS) Strahllinie 24-ID-E gesammelt.

Integrin β5743–774-Linker-PAK4cat: Kristallographische Daten wurden mit dem HKL 2000-Paket55 mit einer Auflösung von 3,5 Å verarbeitet. Eine erste molekulare Ersatzlösung wurde mit Phaser56 unter Verwendung der zuvor bestimmten Kristallstrukturen der katalytischen PAK4-Domäne (PDB-ID:4FIF) erhalten. Dieser ergab einen Z-Score für Übersetzungsfunktionen von 10,4 und die Verfeinerung in der ersten Runde mit Refmac557 ergab R- und Rfree-Werte von 20,0 und 25,1 %. Es wurde eine klare positive Elektronendichtekarte um die katalytische Spalte erhalten, aber aufgrund der schlechten Auflösung entschieden wir uns, die PAK4-Domäne durch Einführung der D440N-Mutation in das chimäre Protein inaktiv zu machen. Das inaktive chimäre Protein war jedoch vermutlich aufgrund einer fehlenden Aktivierungsschleifenphosphorylierung unlöslich, weshalb wir zusätzlich die phosphomimetische Aktivierungsschleifenmutation S474E einführten. Die Integrin-β5743–774-Linker-PAK4catD440N,S474E-Daten wurden mit dem HKL-2000-Paket auf 2,0 Å verarbeitet und Anfangsphasen durch molekularen Ersatz unter Verwendung von PDB ID:4FIF als Modell mit Phaser generiert, was einen Translationsfunktions-Z-Score von 6,8 ergab . Die Verfeinerung des chimären Integrins β5743–774-Linker-PAK4catD440N,S474E wurde unter Verwendung von Refmac5 mit einem Maximum-Likelihood-Target und TLS (Translation, Libration, Screw) durchgeführt. Der Modellaufbau wurde in COOT58 durchgeführt, und während der Verfeinerung wurde die interpretierbare Elektronendichte für Integrin-β5-Reste deutlich sichtbar, die manuell erstellt wurden. Für Adenin von AMP-PNP in der Struktur des Integrins β5743–774-Linker-PAK4catD440N,S474E wird eine schlechte Elektronendichte beobachtet. Insgesamt 45 Aminosäuren sind in der Elektronendichte nicht sichtbar und überbrücken einen Abstand von ~21 Å für den cis-Komplex bzw. einen Abstand von ~31 Å für die Dimerisierung mit symmetriebezogenen Molekülen, obwohl das Modell also in cis aufgebaut wurde Es ist möglich, dass ein trans-Komplex kristallisiert ist. Die Modellqualität wurde mit MolProbity59 bewertet. Co-Kristallstrukturkomplexe: Kristallographische Daten wurden mit dem HKL2000-Paket für das Peptid PAK4cat-Integrin β5760–770 bzw. das Peptid PAK4catD440N, S474E-Integrin β5760–770 auf 1,9 und 2,1 Å verarbeitet. Die ersten Phasen wurden mit Phaser mit der Modell-PDB-ID:4FIF generiert und ergaben Translations-Z-Scores von 7,3 und 8,5 für das Peptid PAK4cat-Integrin β5760–770 und das Peptid PAK4catD440N, S474E-Integrin β5760–770. Sie wurden mit Refmac5 mit einem Maximum-Likelihood-Ziel und TLS verfeinert. Für Adenin von AMP-PNP wird in beiden Strukturen eine schlechte Elektronendichte beobachtet.

Gereinigtes PAK4cat wurde mit 5 mM MgCl2 und 1 mM AMP-PNP vorinkubiert und die rückgefalteten zytosolischen Integrin-β5743–799-Peptide wurden alle dreimal gegen PBS-Puffer (pH 7,4) für das Nano-ITC-Experiment (TA-Instrument) dialysiert. Die Referenzzelle wurde mit Wasser und die Probenzelle mit PAK4cat gefüllt. Die Proteinkonzentrationen wurden mittels UV bestimmt. Für die Interaktion zwischen PAK4 und Integrin β5 wurden 44 und 72 µM PAK4cat in die Probenzelle und 407 µM Integrin β5743–799-Peptide in die Spritze geladen. ITC-Experimente wurden bei 25 °C mit einer Rührgeschwindigkeit von 350 U/min und einer schrittweisen Titration von 20 Injektionen, einem Volumen von 2,5 µL und Intervallen von 300 s durchgeführt. Pufferdaten (PBS-in-PBS-Titration) wurden vor der Datenanpassung vom entsprechenden Experiment abgezogen. Rohdaten wurden verarbeitet und mit der NanoAnalyze-Software (TA-Instrumente) integriert. Die erste Injektion in jedem Experiment wurde für die Analyse nicht berücksichtigt. Stöchiometrie der Wechselwirkung (N), Dissoziationskonstante (Kd), Enthalpieänderungen (ΔH) und Entropie (ΔS) wurden mit der NanoAnalyze-Software bestimmt.

Der Einfluss des zytosolischen Integrins β5 in voller Länge auf die Kinaseaktivität wurde mithilfe eines radioaktiven Tests mit Myelin-Basisprotein (MBP) als Substrat bewertet. Die Tests wurden durch Zugabe von 0,1 µM PAK4cat-Kinase, 2 µM MBP, zytosolischem Volllängenintegrin β5 743–799 (50, 25, 12 und 6 µM) mit 12 µM kaltem ATP und 0,05 µCi heißem [ γ33-P] ATP in Tris-Puffer (20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,3 M NaCl, 1 mM TCEP und 10 mM MgCl2) mit einem Gesamtvolumen von 25 µL. Die Reaktion wurde 7–11 Minuten lang bei 30 °C durchgeführt, dann durch Zugabe von 5× Probenpuffer gestoppt und mittels SDS-PAGE analysiert. Getrocknete Gele wurden analysiert, indem sie einem Phosphorspeichersieb (GE Healthcare) ausgesetzt wurden, gefolgt von einem Scannen mit einem Molecular Imager FX Pro Plus System (Bio-Rad) und durch optische Densitometrie Quantity One (Bio-Rad) quantifiziert. Die Messungen wurden aus drei unabhängigen Experimenten berechnet. Signifikante Unterschiede wurden mit Prism 7 (GraphPad Software) mit ANOVA-Analyse berechnet. Der Einfluss des kurzen Integrin-β5-Peptids auf die Kinaseaktivität wurde mithilfe eines radioaktiven Tests mit einem LIM-Kinasepeptid (RKKRYTVVGN, LIMtide) als Substrat bewertet. Die Konzentration von PAK4 und LIMtide wurde konstant bei 0,2 bzw. 50 µM gehalten. Steigende Konzentrationen des Integrin-β5-Peptids (ERSRARYEMAS) (0, 16, 32, 64, 128, 254, 512, 1024 µM) wurden auf die Kinase-Substrat-Mischung titriert. Die Reaktion wurde in Gegenwart von 1 mg/ml BSA durchgeführt, um unspezifische Bindung abzuschwächen. Alle Komponenten wurden in Kinase-Reaktionspuffer (20 mM HEPES pH 7,4, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT) rekonstituiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von ATP in einer Endkonzentration von 20 µM mit 0,05 µCi γ-32P ATP gestartet. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten lang bei 30 °C inkubiert, wonach ein Aliquot von 7,5 µl auf P81-Filterpapier geblottet wurde. Die Reaktion wurde durch dreimaliges Waschen des P81-Filterpapiers in 75 mM Phosphorsäure in Abständen von 5 Minuten gestoppt. Nach einem abschließenden Waschen mit Aceton wurde das Filterpapier an der Luft getrocknet und zur Analyse im Szintillationszähler in Szintillationsfläschchen mit 6 ml Optifluor-Szintillationsflüssigkeit gegeben. Doppelte Messungen wurden aus drei unabhängigen Experimenten berechnet. Zur Analyse wurde Prism 9 (GraphPad-Software) verwendet.

Pull-Down-Assays wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt45,60. Kurz gesagt, wurden in BL21 (DE3)-Bakterien Konstrukte hergestellt, die für einen N-terminalen His-Tag, gefolgt von einer helikalen Region, einem 4-Glycin-Spacer und einer zytoplasmatischen Integrin-Schwanzsequenz kodieren. Nach der Lyse der Bakterienzellen wurde das rekombinante Protein an Ni-NTA-Perlen gebunden, mit Imidazol eluiert, dialysiert und durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) weiter gereinigt. Gereinigtes Protein wurde zur Lagerung lyophilisiert und zum Beschichten frischer Ni-NTA-Perlen verwendet, um eine Affinitätsmatrix für Pull-Down-Assays zu erzeugen.

Für Pulldowns aus Zelllysaten wurden menschliche PAK4-Konstrukte in pEGFP (Takara Bio Inc.) durch PCR-Amplifikation aus einem pLX304 PAK4-Isoform-1-Konstrukt (Uniprot O96013-1) erzeugt, das freundlicherweise von Michael Calderwood (Dana-Farber Cancer Institute) zur Verfügung gestellt wurde. Mutationen und Deletionen wurden durch QuikChange-Mutagenese oder PCR-Amplifikation eingeführt. Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) wurden auf 10-cm-Gewebekulturschalen ausgesät und vorübergehend mit GFP-markierten Konstrukten unter Verwendung von Polyethylenimin (Polysciences) transfiziert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen geerntet und in Puffer % Desoxycholsäure und vollständige EDTA-freie Proteaseinhibitormischung (Roche, Indianapolis, IN, USA) für 15 Minuten bei 4 °C. Nach der Klärung durch Zentrifugation wurde das Lysat in Puffer XT (Puffer Für Experimente mit gereinigtem PAK4cat wurde das Protein mit His-markierten Integrinschwänzen gekoppelt an Ni-NTA-Kügelchen in Puffer XT für 2 Stunden unter Schütteln bei 4 °C inkubiert. Die Perlen wurden dann dreimal mit Puffer XT gewaschen und die gebundenen Proteine wurden durch reduzierende SDS-PAGE fraktioniert und durch Immunblotting mit Anti-GFP-Antikörpern (600-101-215, Rockland) analysiert. Immunoblots wurden auf einem Odyssey IR-Bildgebungssystem (Li-Cor; Lincoln, NE, USA) abgebildet und mit Image Studio Lite (Li-Cor; Lincoln, NE, USA) analysiert. Zur Quantifizierung der Bindung aus Immunblots wurde die Fluoreszenzintensität der Bande, die dem gebundenen Material entspricht, als Bruchteil der Fluoreszenz der Bande des Eingangsmaterials für jede Bedingung quantifiziert. Die Beladung mit Integrinschwänzen wurde durch Coomassie-Blau-Färbung beurteilt. Die Daten wurden mit GraphPad Prism analysiert.

Die mittleren ±SD- oder SEM-Werte sind angegeben und wurden mit Prism (GraphPad-Software) abgeleitet. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) bestimmt, gefolgt von Dunnetts Mehrfachvergleichstest, der mit Prism Software durchgeführt wurde. P-Werte <0,05 wurden für alle Analysen als signifikant angesehen (*P < 0,05, **P < 0,001, ****P < 0,0001). Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse und die Stichprobengrößen werden in den Legenden zu den Abbildungen erläutert. Daten aus allen ITC-Experimenten werden im Zusatzmaterial gezeigt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Kristallographische Koordinaten und Strukturfaktoren wurden in der Proteindatenbank unter den Zugangscodes 7S46, 7S47 und 7S48 hinterlegt. Röntgenbeugungsbilder sind online verfügbar unter SBGrid Data Bank61: https://doi.org/10.15785/SBGRID/852 (PDB-ID: 7S46), https://doi.org/10.15785/SBGRID/854 (PDB-ID: 7S47) und https://doi.org/10.15785/SBGRID/853 (PDB-ID: 7S48). Nicht zugeschnittene Gele sind in der ergänzenden Abbildung 2 und die Quelldaten in den ergänzenden Daten 1 dargestellt.

Eine Korrektur zu diesem Artikel wurde veröffentlicht: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05176-4

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Wir möchten Ben Turk für seine hilfreichen Ratschläge und den Einsatz der Ausrüstung danken. Amy Stiegler Wyler wird für hilfreiche Diskussionen gedankt. Die APS-Beamline NE-CAT (24-ID-E und -C) wird durch die NIH-Zuschüsse GM103403 und RR029205 gedankt und finanziert. NN wird durch ein Brown Coxe-Stipendium finanziert. Diese Arbeit wurde durch den National Institutes of Health Grant R01GM138411 an DAC und TJB finanziert

Die Abteilung für Pharmakologie, Yale University, 333 Cedar St., New Haven, CT, 06520, USA

Byung Hak Ha, Sezin Yigit, Nalini Natarajan, David A. Calderwood und Titus J. Boggon

Die Abteilung für Zellbiologie, Yale University, 333 Cedar St., New Haven, CT, 06520, USA

Elizabeth M. Morse und David A. Calderwood

Die Abteilung für Molekulare Biophysik und Biochemie, Yale University, 333 Cedar St., New Haven, CT, 06520, USA

Titus J. Boggon

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Führte die Experimente durch: BHH, SY, EMM und NN. Konzipierte und gestaltete Experimente: BHH, SY, EMM, DAC und TJB. Analysierte die Daten: BHH, NN, SY, EMM, DAC und TJB. Verfasste die Arbeit: BHH, NN , SY, EMM, DAC und TJB

Korrespondenz mit David A. Calderwood oder Titus J. Boggon.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur: Gene Chong.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Ha, BH, Yigit, S., Natarajan, N. et al. Molekulare Grundlage für die Bindung des Integrin-Adhäsionsrezeptors an p21-aktivierte Kinase 4 (PAK4). Commun Biol 5, 1257 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04157-3

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Eingegangen: 20. Oktober 2021

Angenommen: 24. Oktober 2022

Veröffentlicht: 17. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04157-3

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