Sensibler Poliovirus-Nachweis mittels Nested-PCR und Nanoporensequenzierung: eine prospektive Validierungsstudie

Nature Microbiology Band 8, Seiten 1634–1640 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Für die Ausrottung des Poliovirus ist die rechtzeitige Erkennung von Ausbrüchen erforderlich, die Goldstandard-Erkennung in der Demokratischen Republik Kongo dauert jedoch 30 Tage (Median). Der direkte molekulare Nachweis und die Nanoporensequenzierung (DDNS) von Polioviren in Stuhlproben sind eine vielversprechende schnelle Methode. Hier berichten wir über prospektive Tests von Stuhlproben von Polio-Verdachtsfällen und deren Kontakten in der Demokratischen Republik Kongo zwischen dem 10. August 2021 und dem 4. Februar 2022. DDNS hat Polioviren in 62/2.339 (2,7 %) der Proben nachgewiesen, was dem Goldstandard entspricht Durch die Kombination von Zellkultur, quantitativer PCR und Sanger-Sequenzierung wurden Polioviren in 51/2.339 (2,2 %) derselben Proben nachgewiesen. DDNS lieferte unter Routineüberwachungsbedingungen innerhalb von 7 Tagen (Median) eine Fallbestätigung. DDNS ermöglichte die Bestätigung von drei Ausbrüchen von zirkulierenden, durch Impfstoffe verursachten Polioviren des Serotyps 2 23 Tage (Mittelwert) früher (Bereich 6–30 Tage) als mit der Goldstandardmethode. Die mittlere Sequenzähnlichkeit zwischen den mit den beiden Methoden erhaltenen Sequenzen betrug 99,98 %. Unsere Daten bestätigen die Machbarkeit der Implementierung von DDNS in einem nationalen Poliovirus-Labor.

Trotz erheblicher Fortschritte, die die Global Polio Eradication Initiative (GPEI) seit ihrer Gründung im Jahr 1988 erzielt hat, bleibt Poliomyelitis in Ländern mit geringer Impfrate ein großes Problem für die öffentliche Gesundheit. Massenimpfkampagnen mit oralem Poliovirus-Impfstoff (OPV) werden bei Poliovirus-Ausbrüchen eingesetzt, um die Übertragung zu stoppen. Allerdings verzögert eine Kombination aus langsamem Versand von Stuhlproben, zeitaufwändiger Virusisolierung mittels Zellkultur und unzureichender Sequenzierungskapazität die Reaktion auf Ausbrüche und verringert die Wirkung von Massenimpfkampagnen1,2,3.

Im August 2020 wurde erklärt, dass die afrikanische Region die Übertragung des wilden Poliovirus (WPV)4 unterbrochen habe. Die Impfung mit OPV hat zu Ausbrüchen des zirkulierenden Impfstoff-abgeleiteten Poliovirus (cVDPV) geführt, der durch die Umkehrung abschwächender Mutationen im Lebendimpfstamm auftritt. Lebendimpfstoffstämme werden nach der Impfung mit dem Kot ausgeschieden und können sich in unterimmunisierten Bevölkerungsgruppen ausbreiten, wobei die abschwächenden Mutationen mit der Zeit verloren gehen5,6. In dieser Post-WPV-Ära kommt es in Afrika und Westasien zu Epidemien des Serotyp-2-cVDPV (cVDPV2) bei Kleinkindern. Im Jahr 2020 wurden 959 Fälle von Lähmungen durch cVDPV2 in 27 Ländern gemeldet, darunter 21 Länder in Afrika7; Im Jahr 2021 wurden weltweit 692 durch cVDPV2 verursachte Fälle und 20 durch cVDPV vom Serotyp 1 verursachte Fälle gemeldet, hauptsächlich in Afrika, einschließlich Nigeria und der Demokratischen Republik Kongo (DRK)8. Im Jahr 2022 wurden mindestens 843 Fälle von VDPV gemeldet, davon 502 in der Demokratischen Republik Kongo8.

In der Demokratischen Republik Kongo kam es 10 Jahre nach dem letzten WPV-Fall aufgrund des Auftretens von cVDPV2 nach der Verwendung von Serotyp-2-OPV als Reaktion auf bestehende Ausbrüche fast kontinuierlich zu einer Zirkulation von cVDPV2. Reaktionen werden durch unzureichende Überwachung und lange Zeiträume bis zur Bestätigung von Ausbrüchen erschwert. Die Poliovirus-Überwachung basiert auf der Sammlung von Stuhlproben von Kindern mit akuter schlaffer Paralyse (AFP) und ihren Kontaktpersonen sowie auf Umweltproben (Abwasserproben). Eine wirksame Poliovirus-Überwachung setzt eine qualitativ hochwertige Probenentnahme und Labortests voraus. Der aus einem AFP-Fall entnommene Stuhl gilt als ausreichend für den Test, wenn zwei Stuhlproben im Abstand von 48 Stunden, innerhalb von 2 Wochen nach Beginn der Lähmung, gesammelt werden und über die Kühlkette mit ordnungsgemäßer Dokumentation eintreffen. In der Demokratischen Republik Kongo lag der Anteil der AFP-Fälle mit unzureichender Stuhlprobenentnahme im Jahr 2018 bei 23 % (Lit. 8). Darüber hinaus führen logistische Herausforderungen beim Probenversand an das Labor, bei der Laboruntersuchung der Proben und beim internationalen Versand (nach Südafrika) zur Sequenzierung zu einer verzögerten Erkennung von Poliovirus-Ausbrüchen. Es wird geschätzt, dass die Fallzahlen aufgrund eines Ausbruchs aufgrund dieser logistischen Probleme pro zusätzliche Woche um etwa 12 % (95 %-Glaubwürdigkeitsintervall 5–21 %) ansteigen9 (Durchschnitt der Daten für die afrikanische Region). Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) identifizierte Verzögerungen bei der Erkennung als eine der größten Herausforderungen für das Polio-Ausrottungsprogramm10.

Die Demokratische Republik Kongo umfasst 2.345.000 km², verfügt jedoch nur über ein von der WHO akkreditiertes Labor am Institut National de Recherche Biomédicale (INRB) in Kinshasa, das für die landesweite biologische Diagnose des Poliovirus verantwortlich ist. Das INRB verwendet ein empfindliches und standardisiertes WHO-Nachweisprotokoll, das Zellkultur mit quantitativer PCR (qPCR) zur intratypischen Differenzierung (ITD) kombiniert. Die Sequenzierung der Poliovirus-VP1-Kapsidregion wird in einem separaten Labor in der Republik Südafrika durchgeführt, wobei eine VP1-Sequenz sowohl zur Bestätigung des Poliovirus-Nachweises oder von Poliovirus-Fällen als auch zur Unterscheidung von cVDPV von Impfstämmen erforderlich ist.

Das GPEI prüft derzeit, welche Ansätze zur Ausrottung der Polio in den letzten beiden WPV-endemischen Ländern, Afghanistan und Pakistan, und zur Bekämpfung von cVDPV-Ausbrüchen in vier der sechs geografischen Regionen der WHO eingesetzt werden sollen3. Die WHO-Strategie zur Polio-Eradikation 2022–2026 (Ref. 3) verpflichtet sich zu Verbesserungen bei der Erkennung und Reaktion. Dazu gehört der direkte Nachweis von Polioviren in Stuhlproben, wodurch die Notwendigkeit eines zellkulturbasierten Nachweisalgorithmus gemäß den weltweiten Zielen zur Eindämmung von Polioviren entfällt11 und die Verlagerung von Poliovirustests und Sequenzanalysen auf Länderebene.

Diese Verbesserungen bei Erkennung und Reaktion könnten durch die Implementierung einer Methode zur direkten molekularen Erkennung und Nanoporensequenzierung (DDNS)12 erreicht werden. DDNS kombiniert einen schnellen, direkten Nachweis aus Stuhlproben mit einer Sequenzierung vor Ort, wodurch der internationale Transport von Proben vermieden und eine schnelle Reaktion auf Ausbrüche ermöglicht wird9. Es könnte in jedem Labor implementiert werden, das bereits PCR verwendet, einschließlich INRB, in dem Illumina und Nanoporensequenzierung für Ebolavirus, Masern, Affenpocken und das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 verwendet wurden (Ref. 13,14).

Um die DDNS-Implementierung zu validieren, damit sie vom WHO Global Polio Laboratory Network (GPLN)15 als empfohlene Methode angesehen werden kann, haben wir in diesem Artikel eine prospektive Studie in der Demokratischen Republik Kongo durchgeführt, um die Anwendung des DDNS-Protokolls zu bewerten und es mit Gold zu vergleichen Standard-Zellkulturmethoden zur Überwachung von Polioviren. Hier berichten wir über die Sensitivität und Spezifität von DDNS im Vergleich zur Zellkultur, die Sequenzierungsgenauigkeit, den Zeitaufwand im Labor und die damit verbundenen Kostendaten.

Stuhlproben wurden parallel mit dem DDNS- und dem Goldstandard-Assay getestet. Insgesamt 2.339 potenzielle Stuhlproben aus 1.159 AFP-Fällen (jeweils 1 oder 2 Proben) und 62 Fallkontakten oder Gemeinschaftsproben (jeweils 1 Probe) wurden mithilfe von 26 Nanoporen-Sequenzierungsläufen in einem Zeitraum von 141 Tagen verarbeitet, was im Durchschnitt einem Sequenzierungslauf entspricht alle 5,4 Tage. DDNS identifizierte 62 Proben (2,7 % aller Proben) als positiv für Poliovirus, wobei 36 cVDPV2 (1,58 %), 5 Sabin-Serotyp 1 (0,30 %), 19 Sabin-Serotyp 3 (0,90 %) und 2 die Serotypen 1 und 3 Sabin enthielten Poliovirus (0,09 %) (Tabelle 1). Der Goldstandard-Assay identifizierte Polioviren in 51 Proben, davon waren 31 Proben VDPV vom Serotyp 2 (1,33 %), 4 Proben vom Sabin-Serotyp 1 (0,17 %) und 16 Proben vom Sabin-Serotyp 3 (0,68 %).

Die Sensitivität und Spezifität des Nachweises für jeden Poliovirus-Typ für DDNS oder den aktuellen Goldstandard-Assay ist in Tabelle 2 dargestellt. Das mit beiden Methoden nachgewiesene cVDPV2 stellte keine Kontamination dar, da sich die Sequenzen von denen anderer Proben unterschieden (wie in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt). Die Sensitivität und Spezifität der beiden Methoden unterschieden sich nicht wesentlich (exakter Fisher-Test).

Für 1.118 AFP-Fälle standen zwei Stuhlproben zur Verfügung, wobei 37 Fälle mit beiden Methoden positiv auf Poliovirus waren. In achtzehn Fällen gab es eine vollständige Übereinstimmung zwischen beiden Methoden, wobei beide Proben positiv getestet wurden (Ergänzungstabelle 1). Es gab keine Fälle, in denen beide Proben im Goldstandard-Assay positiv getestet wurden und kein positives DDNS-Ergebnis ergaben, wohingegen in neun Fällen mit positiven DDNS-Ergebnissen im Goldstandard-Assay kein Poliovirus nachgewiesen wurde.

Für 1.159 AFP-Fälle stand eine einzelne Probe oder ein Probenpaar zur Verfügung. Die Sensitivität und Spezifität des Nachweises wurden für jeden AFP-Fall berechnet (Tabelle 3) und nur für AFP-Fälle, bei denen zwei Stühle verfügbar waren (n = 1.118 Fälle; Ergänzungstabelle 2).

Während dieses Untersuchungszeitraums wurde bei 27 Proben, die VDPV2 enthielten, die VP1-Region mit beiden Diagnosemethoden sequenziert. Nur Proben von programmatischer Bedeutung (bei denen möglicherweise eine Impfreaktion erforderlich ist; alle Serotyp-2-Viren und alle vermuteten Impfstoff- und Wildtyp-Polioviren) werden nach der Zellkultur sequenziert, wohingegen DDNS eine Sequenz für positive Proben erzeugt, ohne dass eine zusätzliche Sequenzierung an anderer Stelle erforderlich ist. Für diese 27 Proben war ein Median von 6 Tagen zwischen Fallbeginn und Probenentnahme (Bereich 2–21 Tage) und weitere Median 6 Tage zwischen Probenentnahme und Eintreffen der Proben im Sequenzierungslabor (Bereich 2–27 Tage) erforderlich. . Die Zeit vom Eingang im Sequenzierungslabor bis zur VP1-Sequenz dauerte mit dem Standardalgorithmus im Median 30 Tage (Bereich 21–41 Tage), einschließlich eines Medians von 8 Tagen (Bereich 4–22 Tage), der für den Versand zwischen der Virusisolierung erforderlich war und Sequenzierungslabor, während DDNS deutlich schneller war (P < 0,001, Mann-Whitney-U-Test) und einen Median von 7 Tagen (Bereich 4–23 Tage) erforderte (Abb. 1).

Die Zeitspanne zwischen Fallbeginn und der Generierung einer Sequenz über DDNS und den Standardalgorithmus wurde mithilfe eines zweiseitigen Mann-Whitney-U-Tests verglichen.

Quelldaten

Während des Untersuchungszeitraums kam es in der Provinz Maniema in der Demokratischen Republik Kongo zu vier cVDPV2-Ausbrüchen, die durch den routinemäßigen Goldstandardalgorithmus bestätigt wurden. Für zwei der Linien (RDC-MAN-3 und RDC-MAN-4) wurde die Probe zur Bestätigung der Zirkulation (zweiter Fall) während des Untersuchungszeitraums entnommen, während für RDC-MAN-2 die Bestätigungsprobe 42 Tage vor der Studie entnommen wurde erfasst und während der Ausbildung verarbeitet. Der Goldstandard-Erkennungsalgorithmus benötigte 27, 35 bzw. 64 Tage (durchschnittlich 42 Tage), um diese Proben von der Sammlung bis zur Sanger-Sequenzierung zu verarbeiten. Dieselben Proben wurden von DDNS in 6, 20 bzw. 30 Tagen verarbeitet, obwohl die Proben für RDC-MAN-2 vor dem Untersuchungszeitraum gesammelt wurden, was im Mittel 23 Tage schneller ist. Bei der vierten Ausbruchslinie, RDC-MAN-5, wurde während des Untersuchungszeitraums nur die erste positive Probe gesammelt, aber diese Probe ergab ebenfalls 29 Tage zuvor eine VP1-Sequenz durch DDNS. Die geografische Verteilung der von DDNS identifizierten Fälle für die vier Ausbrüche und die Verwandtschaft der RDC-MAN-3-Ausbruchslinie ist in Abb. 2 dargestellt. Basierend auf der molekularen Uhr des Poliovirus VP1 und diesen von DDNS abgeleiteten VP1-Sequenzen schätzen wir, dass der RDC-MAN Die Abstammungslinie -3 ging aus einer OPV2-Impfkampagne hervor, die im ersten Quartal 2020 durchgeführt wurde (mittleres Datum 26. Januar 2020, 95 % höchste hintere Dichte 4. April 2019 bis 16. September 2020).

a: Fälle aus den vier Maniema-Linien, die während des Untersuchungszeitraums entdeckt wurden (Provinz Maniema grün hervorgehoben). Die Fälle werden nach Distrikt gegliedert, wobei die Platzierung innerhalb des Distrikts nach dem Zufallsprinzip bestimmt wird. b, Spitzendatierter phylogenetischer Baum, der das Entstehungsdatum der RDC-Man-3-Linie mit maximaler Wahrscheinlichkeit und ihre anschließende Diversifizierung im Laufe der Zeit zeigt. Feste Spitzen weisen darauf hin, dass der DDNS-Nachweis mit einem zellkulturbasierten Nachweis eines cVDPV2 aus derselben Probe übereinstimmte. Durch Sanger-Sequenzierung bestätigte Fälle, jedoch ohne entsprechende DDNS-Sequenz (n = 2), wurden nicht in die Analyse einbezogen.

Quelldaten

Wenn Konsensus-cVDPV2-VP1-Sequenzen sowohl von DDNS als auch von der Sanger-Sequenzierung des Kulturisolats für dieselbe Probe verfügbar waren, wurde die Ähnlichkeit der Sequenzen bestimmt. Die mittlere VP1-Sequenzidentität beim Vergleich von DDNS und dem Goldstandardalgorithmus (einschließlich Sanger-Sequenzierung) für die 27 cVDPV2 mit Ergebnissen für beide Methoden betrug 99,98 % (Bereich 99,60–100 %). Die absolute Anzahl der Unterschiede zwischen den Sequenzen ist in Tabelle 4 dargestellt.

Die Kosten für die Verbrauchsmaterialien für den DDNS-Assay betragen etwa 20 US-Dollar pro Probe bei der Durchführung von Multiplex-Sequenzierungsläufen mit 96 Proben oder 25 US-Dollar pro Probe bei der Durchführung von Läufen mit 45 Proben in Labors mit geringerem Durchsatz (Ergänzungstabelle 3). Diese Zahlen umfassen Chloroformbehandlung, RNA-Extraktion, Nested-PCR und Nanoporensequenzierung. Für die Chloroformbehandlung, Zellkultur und qPCR allein kostet der zellkulturbasierte Erkennungsalgorithmus etwa 31 US-Dollar (Ergänzungstabelle 3), zusätzlich zu den Kosten für die Sanger-Sequenzierung und den Versand an das National Institute for Communicable Diseases (NICD) in Südafrika wo die Sequenzierung durchgeführt wird. Während für beide Methoden einige große Ausrüstungsgegenstände erforderlich sind, vermeidet DDNS die Anforderungen von Mikroskopen, Inkubatoren, Zellzählern und Gewebekulturschränken und erfordert lediglich die Hinzufügung eines MinION- oder GridION-Sequenzers (wobei MinIONs normalerweise 1.000 US-Dollar kosten, einschließlich Sequenzierungsreagenzien). Kit und einer Durchflusszelle). Die Kosten für Personal und Einrichtungen wurden in den Zahlen nicht berücksichtigt, dennoch waren für die Durchführung von DDNS am INRB nur fünf Mitarbeiter erforderlich; drei Laborwissenschaftler für RNA-Extraktion, verschachtelte Reverse Transkription (RT)-PCR und Nanoporensequenzierung und zwei Bioinformatiker/Datenmanager für die Datenqualitätskontrolle und den Abgleich der Sequenzen mit den Falldaten. Vergleichbare Schritte aus dem zellkulturbasierten Algorithmus erfordern vier Laborwissenschaftler für Zellkultur und qPCR, zwei Hilfskräfte für die Wartung der Einrichtungen und die Unterstützung von zusätzlichem Sequenzierungspersonal und Bioinformatikern am NICD.

Hier berichten wir über eine prospektive Validierungsstudie, in der DDNS mit dem Goldstandard-Assay zum Nachweis von Polioviren in Stuhlproben in der Demokratischen Republik Kongo verglichen wurde. Unsere Daten bestätigen, dass DDNS als schnelles, sensibles und kostengünstiges Instrument zur Überwachung in der Demokratischen Republik Kongo eingesetzt werden kann. Unsere Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, DDNS in einem nationalen Poliovirus-Labor zu implementieren. Obwohl für einen direkten Vergleich mit dem Goldstandard-Assay keine statistische Aussagekraft besteht, zeigt unsere Studie, dass DDNS für den Nachweis von Polioviren mindestens genauso empfindlich ist wie Kultur.

Die Implementierung von DDNS in dieser Studie zeigt, dass es Polioviren schneller erkennt als Zellkulturen. DDNS-VP1-Sequenzen für VDPV2-positive Proben wurden im Durchschnitt 14 Tage nach der Stuhlentnahme generiert. Dies ähnelt den 12 Tagen, die wir bei der Schätzung der Leistung von DDNS basierend auf Stuhlprobensammlungen von 2016 bis 2020 vorhergesagt haben, ist jedoch etwas langsamer (Lit. 9). Unsere früheren Schätzungen berücksichtigten die Probenstapelung nicht, um die Effizienz zu maximieren und die Kosten zu minimieren. Weitere Geschwindigkeitsverbesserungen könnten durch automatisierte RNA-Extraktion oder durch eine Verkürzung der Probenlieferzeit zum Labor erreicht werden, möglicherweise durch Drohnen bei schlechten Straßenverhältnissen16, oder durch die Einrichtung zusätzlicher regionaler Labore in der Demokratischen Republik Kongo.

Für Proben, die zur Bestätigung von drei der vier cVDPV2-Linien erforderlich sind, generierte DDNS die VP1-Sequenz, die erforderlich ist, um eine Reaktion im Mittel 23 Tage (Bereich 6–30 Tage) schneller als in Kultur auszulösen. Eine frühere Erkennung und Reaktion auf Ausbrüche führt zu weniger Fällen und einer höheren Wahrscheinlichkeit, die laufende Übertragung einzuschränken2,9. Trotz der geringeren Genauigkeit der Rohlesesequenzierung von Nanoporen im Vergleich zur Sanger-Sequenzierung ergab die Generierung von Konsenssequenzen eine mittlere Ähnlichkeit von 99,98 %. Die Sequenzidentität betrug nur bei 2/27 Proben <100 %. Wenn ein relativ großer Unterschied beobachtet wurde (die Probe mit vier Nukleotidunterschieden zwischen Konsensussequenzen aus DDNS und Sanger-Sequenzierung), kann dies auf unterschiedliche Viruspopulationen im Darm des AFP-Falls hinweisen. In diesem Fall wurden zwei Stuhlproben im Abstand von einem Tag entnommen, und die Sanger-Sequenzen für das Paar unterschieden sich ebenfalls um ein Nukleotid. Durch die Entfernung konkurrierender viraler Zellkulturen und den Einsatz von Sequenzierung der nächsten Generation ermöglicht DDNS jedoch die Identifizierung mehrerer viraler Template aus einer einzigen Probe, wie durch den Nachweis von Sabin 1 und Sabin 3 in zwei der Proben gezeigt wird. Eine verbesserte Benennung von Haplotypen könnte sogar die Auflösung sehr eng verwandter Viruspopulationen (die sich nur um ein oder zwei Nukleotide unterscheiden) aus einer einzigen Probe ermöglichen.

Die zusätzlichen Poliovirus-Nachweise durch DDNS waren wahrscheinlich nicht auf eine Kontamination zurückzuführen, da sie dazu neigten, entweder in Probenpaaren aus demselben AFP-Fall oder in Probenpaaren aufzutreten, bei denen die Kultur positiv auf eines der Paare getestet wurde. Darüber hinaus ermöglicht DDNS eine schnelle Identifizierung einer Kontamination mit Viren von programmatischer Bedeutung (Wildtyp und VDPVs), da die Wahrscheinlichkeit identischer VP1-Sequenzen außer bei Proben, die aus demselben Fall oder deren Kontakt entnommen wurden, gering ist. Es wurde ein Qualitätssicherungsprogramm für DDNS entwickelt, einschließlich der Verwendung einer lyophilisierten Virus-Positivkontrolle und von Qualitätskontroll-Flags, die in eine maßgeschneiderte Software integriert sind, die jetzt für DDNS entwickelt wurde (PIRANHA17).

Für die Implementierung der Methode ist keine Zellkulturanlage oder die Übertragung von Proben an ein ausländisches Labor zur Sanger-Sequenzierung erforderlich, wenn die lokalen Kapazitäten nicht verfügbar sind, sodass alle Schritte an einem Standort in einem einzigen optimierten Arbeitsablauf durchgeführt werden können. Die Kosten pro Probe sind für Labore mit hohem Durchsatz, die den Nutzen des Probenmultiplexings während der Sequenzierung maximieren können, um mindestens 10 US-Dollar niedriger. Dies schließt weitere Einsparungen durch den internationalen Versand von Proben und die Sequenzierung an einem zentralen Hub aus. Während die Personalgehälter und die Kosten für Einrichtungen nicht in diese Berechnungen einbezogen wurden (und von Land zu Land stark variieren werden), wurde routinemäßiges DDNS am INRB mit Beiträgen von fünf Mitarbeitern implementiert, im Vergleich zu sechs bei der Zellkulturmethode. Darüber hinaus unterstützte es eine Belegschaft, die in molekularen Techniken geschult war, einschließlich der Vorbereitung von Sequenzierungsbibliotheken, der Durchführung von Sequenzierungen und der Analyse von Sequenzierungsdaten. Die für DDNS erforderlichen Fähigkeiten und Einrichtungen können bei Notfällen im Bereich der öffentlichen Gesundheit schnell auf andere Krankheitserreger übertragen werden. Mit der globalen Ausweitung der Sequenzierungskapazitäten gibt es zunehmend Möglichkeiten, die Entwicklung dieser Fähigkeiten zu fördern und ihren Beitrag zur Krankheitsüberwachung und Pathogengenomik zu erleichtern, möglicherweise durch zentralisierte bioinformatische Unterstützung entweder vom GPLN oder von subregionalen Laboren mit Fachwissen (z. B. INRB). ) oder von anderen regionalen Einrichtungen (zum Beispiel der Pathogen Genomics Initiative des Africa CDC).

Ein Vorteil von DDNS ist das Potenzial, die Zellkultur in den meisten Poliolabors vollständig zu ersetzen, was sowohl kostspielig als auch unerwünscht ist, da das Poliovirus weltweit eingedämmt wird18. Damit DDNS aufrechterhalten werden kann, müssen Herausforderungen bei den Lieferketten überwunden werden, da Länder, die wahrscheinlich am meisten von der schnellen Erkennung profitieren, wahrscheinlich auch schwieriger mit Reagenzien für die Nanoporensequenzierung zu versorgen sein dürften. Vor der Implementierung wäre auch eine vollständige wirtschaftliche Kostenkalkulation für die Implementierung im gesamten GPLN erforderlich. Für Labore, die auch Umweltüberwachungsproben (ES) testen, kann DDNS für diese Proben verwendet werden, um Sequenzierungsablesungen für mehrere Virusvorlagen bereitzustellen, wie sie im Abwasser vorkommen können12. Direkte Nachweismethoden erlauben jedoch typischerweise nur relativ kleine Probenahmevolumina (Hunderte Mikroliter für eine RNA-Extraktion im Gegensatz zu 4 ml für die acht derzeit verwendeten Zellkulturflaschen); Daher sind höhere Konzentrationen an ES-Proben und/oder großvolumige RNA-Extraktionen erforderlich, um eine ähnliche oder höhere Nachweisempfindlichkeit zu erreichen. Wir optimieren diese Methoden derzeit für ES-Proben, die sehr vielversprechend sind19.

Während dieser Forschungsstudie wurden keine Sequenzen verwendet, um die Reaktion auf Ausbrüche zu informieren, da die Methode noch nicht vom GPLN akzeptiert oder empfohlen wurde15. Wir arbeiten jetzt daran, die Anforderungen für die GPLN-Empfehlung zu erfüllen, einschließlich der Pilotimplementierung von DDNS in weiteren Labors weltweit. Eine zusätzliche Methode des direkten Nachweises durch qPCR20 (ohne Sequenzierung) wird vom GPEI evaluiert, ein Vergleich zwischen dieser Methode und DDNS wurde noch nicht durchgeführt. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um die Erkennungsgenauigkeit und die Geschwindigkeit, mit der eine VP1-Sequenz mit den beiden Methoden generiert werden kann, zu vergleichen. Außerdem sind die einfache Implementierung und der Schulungsbedarf des Personals zu berücksichtigen.

Stuhlproben wurden während der routinemäßigen AFP-Überwachung in der Demokratischen Republik Kongo zwischen dem 10. August 2021 und dem 4. Februar 2022 entnommen. Diese diagnostischen Proben wurden im Rahmen des routinemäßigen Programms des Gesundheitsministeriums der Demokratischen Republik Kongo zur Überwachung von Krankheiten im öffentlichen Gesundheitswesen und zur Ausrottung der Kinderlähmung entnommen, weshalb auf die Zustimmung zur Probenentnahme verzichtet wurde . Die gesamte Probenvorbereitung für die Sequenzierung, Genomanalyse und Datenanalyse erfolgte an anonymisierten Proben, die nur durch ihr Labor oder den epidemiologischen Identifikator identifizierbar waren. Alle relevanten ethischen Vorschriften wurden befolgt.

Alle 2.339 beim Nationalen Poliolabor (INRB) eingegangenen Proben von AFP-Fällen, der Community und Kontakten wurden in dieser Studie verarbeitet. Es wird empfohlen, innerhalb von 14 Tagen nach Beginn der Lähmung und im Abstand von mindestens 24 Stunden zwei Stuhlproben von Kindern im Alter von 0 bis 14 Jahren mit AFP zu entnehmen. Einzelne Stuhlproben von gesunden Kontaktpersonen von Kindern mit AFP werden in der Regel zusätzlich von Kindern unter 5 Jahren und gelegentlich auch von der breiteren Gemeinschaft entnommen.

Mit Chloroform behandelter Stuhlüberstand wurde wie in Lit. beschrieben hergestellt und verarbeitet. 21 im Rahmen der routinemäßigen Poliovirus-Stuhlüberwachung. Kurz gesagt, 0,8 ml mit Chloroform behandelter Stuhlüberstand wurden in zwei Kulturflaschen mit L20b-Zellen und zwei Flaschen mit RD-Zellen inokuliert. Nach zwei Passagen wurde 1 μl des Überstands von Kulturflaschen, in denen die Zellen vermutete zytotoxische Wirkungen des Poliovirus auf L20B gezeigt hatten, für die intertypische qPCR-Differenzierung unter Verwendung des Poliovirus rRT-PCR ITD v5.2-Kits gemäß dem Protokoll des Herstellers mit routinemäßiger weiterer Untersuchung von VDPVs verwendet .

Wo eine Sequenzierung erforderlich war, wurde die Isolatkultur auf Karten von Flinders Technology Associates getrocknet und zur Sanger-Sequenzierung an das NICD in Südafrika geschickt.

Der mit Chloroform behandelte Stuhlüberstand wurde einer RNA-Extraktion unterzogen, wobei entweder QIAamp Viral RNA Mini Kits (#51106, verwendet für Proben, die von August 2021 bis September 2021 verarbeitet wurden) oder Roche High Pure Viral RNA Kits (#11858882001, verwendet für Proben, die von Oktober 2021 bis Februar 2022 verarbeitet wurden) verwendet wurden. gemäß den Herstellerprotokollen unter Verwendung eines Volumens von 140 µl bzw. 200 µl Überstand. Die Auswahl des RNA-Extraktionskits wurde durch die Kitverfügbarkeit bestimmt, aber beide Kits wurden für die DDNS-Methode validiert22. Extrahierte RNA wurde während der Vorbereitung der Nested-PCR bei +4 °C gelagert, wenn sie am selben Tag durchgeführt wurde, oder bei –80 °C, wenn die Verzögerung mehr als 24 Stunden betrug.

DDNS basierend auf einer verschachtelten PCR mit Barcode und Amplikonsequenzierung auf Nanoporensequenzierern wurde wie in Lit. beschrieben durchgeführt. 12. Kurz gesagt, eine verschachtelte PCR wurde unter Verwendung von 5 µl extrahierter RNA und Pan-Enterovirus-Primern23 durchgeführt, wobei das Produkt für eine Poliovirus-spezifische VP1-PCR unter Verwendung von Barcode-Primern12 verwendet wurde. Zwei Mikroliter jedes PCR-Produkts wurden vor der Reinigung mit AMPure XP-Perlen (Beckman Coulter, Nr. A63880) gepoolt und die Sequenzierungsbibliothek mit LSK-110-Ligationssequenzierungskits von Oxford Nanopore Technologies erstellt. Das vollständige Protokoll finden Sie in Ref. 24.

Die Bibliotheken wurden auf den GridION-, MK1c- oder MinION-Sequenziergeräten von Oxford Nanopore Technologies zwischen 4 und 12 Stunden lang unter Verwendung von R9.4-Durchflusszellen sequenziert. Die Sequenzierungsläufe wurden zwischen dem 29. September 2021 und dem 17. Februar 2022 durchgeführt. Dem Studienteam, das DDNS durchführte, waren die Ergebnisse des Goldstandardalgorithmus während der Probenverarbeitung nicht bekannt.

Das Sequenz-Basecalling wurde mit Guppy durchgeführt, mit Demultiplexierung und Zuordnung der Lesevorgänge, die mit RAMPART25,26 und dem Echtzeit-Polio-Analysemodul25 durchgeführt wurden. VP1-Konsenssequenzen wurden durch vier iterative Mapping-Runden unter Verwendung des Mafft-Algorithmus27 und Polieren mit Racon28 vor dem Konsensaufruf mit Medaka29 generiert. Der datierte Maximum-Likelihood-Baum für den RDC-MAN-3-Ausbruch wurde in R-Version 4.1.3 unter Verwendung des Analyses of Phylogenetics and Evolution (Ape)-Pakets30, des Phylogenetic Reconstruction and Analysis (Phangorn)-Pakets31 und des Treedater-Pakets32 erstellt. Basierend auf Lit. wurde eine molekulare Taktrate von 0,01 Substitutionen pro Stelle und Jahr angenommen. 33.

Die Zeitspanne zwischen Fallbeginn und der Generierung einer Sequenz über DDNS und den Standardalgorithmus wurde mithilfe eines zweiseitigen Mann-Whitney-U-Tests verglichen. Für die Sensitivität und Spezifität der beiden Methoden wurden genaue binomiale Konfidenzintervalle berechnet und ein Vergleich mithilfe eines zweiseitigen exakten Fisher-Tests durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die während dieser Studie generierten Sequenzen sind im European Nucleotide Archive unter der Zugangsnummer PRJEB61181 verfügbar. Beispielmetadaten sind in Quelldaten Abb. 2 dargestellt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Die aktuelle Version der Analysesoftware zur Analyse von DDNS-Daten finden Sie unter https://github.com/polio-nanopore/piranha.

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Referenzen herunterladen

Wir danken allen Mitgliedern des INRB Pathogen Genomics Laboratory für ihre Unterstützung bei dieser Arbeit, insbesondere P. Paku, R. Lumembe, G. Kabamba, F. Muyembe, R. Ola und C. Musuamba. Wir danken auch den Datenmanagern des Poliovirologielabors T. Changa Changa und J.-C. Changa Changa für ihre Zusammenarbeit. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Bill and Melinda Gates Foundation (OPP1171890 und OPP1207299) unterstützt. AS, CT, JA und NCG danken für die Finanzierung durch das MRC Centre for Global Infectious Disease Analysis (Referenz MR/R015600/1), gemeinsam finanziert vom UK Medical Research Council (MRC) und dem UK Foreign, Commonwealth & Development Office (FCDO). , im Rahmen des MRC/FCDO-Konkordatabkommens und sind auch Teil des von der Europäischen Union unterstützten EDCTP2-Programms; und bedanken uns für die Finanzierung durch Community Jameel. NCG wird vom Polio-Forschungsausschuss der WHO finanziert. CP und BW danken der Bill and Melinda Gates Foundation für die Finanzierung (INV-025345). TKM, ELL, AAA, EKL, JCMC, MA, YL, BN, EP, YR und PM-K. danken der Africa CDC Pathogen Genomics Initiative (Africa PGI) für ihre Unterstützung. AO und AR bedanken sich für die Unterstützung des Wellcome Trust (Collaborators Award 206298/Z/17/Z–ARTIC).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Alexander G. Shaw, Tresor Kabeya Mampuela, Emmanuel Lokilo Lofiko, Catherine Pratt.

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Javier Martin, Nicholas C. Grassly, Placide Mbala-Kingebeni.

MRC Centre for Global Infectious Disease Analysis, School of Public Health, Imperial College London, London, Großbritannien

Alexander G. Shaw, Catherine Troman, Joyce Odeke Akello, David Jorgensen und Nicholas C. Grassly

Mikrobiologischer Dienst, Abteilung für Medizinische Biologie, Universitätskliniken Kinshasa (CUK), Universität Kinshasa (UNIKIN), Kinshasa, Demokratische Republik Kongo

Mit der Genius-Suchmaschine gibt es über 1000 Videos in allen Formaten von YouTube

Nationales Institut für biomedizinische Forschung, Kinshasa, Demokratische Republik Kongo

Es gibt viele Gründe, warum Sie diese Produkte nicht kaufen sollten, aber diese sind die Gründe, warum Sie diese Produkte nicht kaufen sollten. Dies sind die Gründe, warum Sie diese Produkte nicht kaufen sollten. Dies sind die Gründe, warum Sie diese Produkte nicht kaufen sollten diese Produkte

College of Public Health, University of Nebraska Medical Center, Omaha, NE, USA

Catherine Pratt & Bailey White

Abteilung für Impfstoffe, National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC), Regulierungsbehörde für Arzneimittel und Gesundheitsprodukte, Potters Bar, Großbritannien

Erika Bujaki & Javier Martin

Institut für Ökologie und Evolution, Universität Edinburgh, Ashworth Laboratories, Edinburgh, Großbritannien

Anne O'Toole und Andrew Rambaut

TransVIHMI (Translationale Forschung zu HIV und endemischen und neu auftretenden Infektionskrankheiten), Universität Montpellier (UM), Französisches Nationales Forschungsinstitut für nachhaltige Entwicklung (IRD), INSERM, Montpellier, Frankreich

Eddy Kinganda Lusamaki

Bill und Melinda Gates Foundation, Seattle, WA, USA

Von Kathleen E. Rankin

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AGS, TKM, ELL, CP, EKL, AO, KER, JM, NCG und PM-K. hat die Arbeit geschrieben. AGS, TKM, CP, CT, EB, JOA, AAA, JCM, MA, YL, BN, BW und EP führten die experimentellen Arbeiten durch. AO und AR erstellten und entwickelten die Software-Pipeline für die Verarbeitung von Sequenzierungsdaten. AGS, ELL, CP, AO, EKL, DJ, JM und NCG führten die Datenanalyse durch. YR, KER, AR, SAM, JJM, JM, NCG und PM haben die Studie erstellt. AGS, TKM, ELL, CP und AAA überwachten die Durchführung der Studie. Alle Autoren haben die endgültige Arbeit überprüft und genehmigt.

Korrespondenz mit Alexander G. Shaw.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Microbiology dankt Steve Kroiss, Melinda Suchard und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Ergänzende Tabellen 1–3 und Abb. 1.

Tabelle der benötigten Zeit für jeden Schritt in jeder Methode.

Deskriptoren von DDNS-Sequenzen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Shaw, AG, Mampuela, TK, Lofiko, EL et al. Sensibler Poliovirus-Nachweis mittels Nested-PCR und Nanoporensequenzierung: eine prospektive Validierungsstudie. Nat Microbiol 8, 1634–1640 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01453-4

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Eingegangen: 16. März 2023

Angenommen: 19. Juli 2023

Veröffentlicht: 17. August 2023

Ausgabedatum: September 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01453-4

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