Nanoplasmonische Beschleunigung der Nukleinsäureamplifikation zum Nachweis von Krankheitserregern

Nature Nanotechnology Band 18, Seiten 846–847 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Ein automatisiertes System, das Mikrofluidik mit plasmonischer Injektion heißer Elektronen koppelt, um den kolorimetrischen Nachweis der DNA- und RNA-Amplifikation zu beschleunigen, erreicht nachweislich eine Nachweisgenauigkeit von 95 % in menschlichen Speichelproben. Diese Technik verwendet verschiedene Amplifikationstests zur Identifizierung von Krankheitserregern und kann zwischen viralen Varianten und Subtypen unterscheiden.

Die langwierigen Protokolle, die mit Assays verbunden sind, die auf dem Nachweis und der Replikation von Nukleinsäuren durch Nukleinsäuresonden (Amplifikationsassays) basieren, erschweren den schnellen Nachweis von Krankheitserregern am Ort des Bedarfs, geschweige denn die Automatisierung des Prozesses von der Probenvorbereitung bis zum Ergebnis1. Diese Einschränkung behindert die Entscheidungsfindung hinsichtlich der Bekämpfung der Ausbreitung viraler Atemwegsinfektionen, die aufgrund ihrer steigenden Inzidenz zunehmend Auswirkungen auf die Weltbevölkerung und die Wirtschaft haben. Solche Einschränkungen wurden besonders in den frühen Stadien der COVID-19-Pandemie deutlich, als weltweit Anstrengungen unternommen wurden, diagnostische Tests zu entwickeln und einzusetzen. Derzeit sind Antigentests aufgrund ihrer einfachen und schnellen Handhabung die Tests der Wahl für Point-of-Need-Einrichtungen. Allerdings weisen Antigentests eine geringere Empfindlichkeit auf als Polymerase-Kettenreaktionstests (PCR)2, was ihre Anwendbarkeit als fundierte Entscheidungshilfe im Gesundheitswesen zu Beginn einer Infektion beeinträchtigt.

Wir schlagen eine Technik – QolorEX – vor, um eine markierungsfreie quantitative kolorimetrische Anzeige mit Einzelnukleotidauflösung zu erhalten, die innerhalb von Minuten ein Ergebnis liefern kann. Dieser Ansatz integriert Phenolrot-basierte kolorimetrische Assays mit Reverse-Transkriptionsschleife-vermittelter isothermer Amplifikation (RT-LAMP) und Rolling-Circle-Amplifikation (RCA)3 mit miniaturisierten plasmonischen Nanooberflächen-Mikrofluidiken, um eine plasmonische Hot-Spot-Katalyse zu erreichen4. Um die Amplifikationsreaktion zu rationalisieren, haben wir eine mikrofluidische Kartusche entwickelt, die eine einstellbare winkelabhängige mikrofluidische Betätigung verwendet, um den gesamten Zyklus der Probenentnahme, Lyse, Zugabe von Testreagenzien, Nukleinsäureamplifikation und Detektion zu integrieren (Abb. 1a). Um vom Benutzer verursachte Fehler zu reduzieren, haben wir eine beleuchtungsgekoppelte Bildgebungsbox mit automatisierten Aktuatoren entwickelt, um die Mikrofluidikkartusche zu handhaben, zu erhitzen und abzubilden, ohne dass Eingaben des Benutzers erforderlich sind. Diese Automatisierung ermöglicht es dem Benutzer, auf eine Schaltfläche in einer Mobiltelefonanwendung zu tippen, um den sequentiellen Betrieb der Mikrofluidikkartusche zu starten. Die kolorimetrische Anzeige wird automatisch von der in die Imaging-Box integrierten Komplementär-Metalloxid-Halbleiterkamera (CMOS) erkannt. Ein maschineller Lernalgorithmus analysiert dann die Anzeige und stellt positive oder negative Ergebnisse fest; Das Ergebnis wird dann an das Mobiltelefon des Benutzers gesendet.

a, Ein Schema der Funktionsweise von QolorEX. Der Benutzer spuckt Speichel in den Sammeltrichter und legt die Mikrofluidikkartusche in die Bildgebungsbox. Die Ergebnisse werden dann automatisch über eine Smartphone-App übermittelt. b, Bei Lichtanregung beschleunigt das plasmonische Nanomaterial den Amplifikationstest aufgrund der überschüssigen Elektronen an der Reaktionsschnittstelle. Die erhöhte Amplifikationsrate erhöht die Produktionsrate von Protonen, die den pH-Wert des Mediums senken, was dazu führt, dass das Phenolrot in Gegenwart des Zielpathogens (siehe Einschub) schnell seine Farbe von Fuchsia nach Gelb ändert. dNTP, Desoxyribonukleotidtriphosphat; DOS, Zustandsdichte; E, Energie; EF, Fermi-Energie; ϕAssay, Initiierungsenergie der Oxidationsreaktion; ħω, Photonenenergie; ΔV, Erfassungskammervolumen. © 2023, AbdElFatah, T. et al.

Wir haben gezeigt, dass die mit QolorEX erzielte schnelle kolorimetrische Anzeige stark von der Injektion lichtangeregter „heißer“ Elektronen von der Oberfläche selbstorganisierter plasmonischer Nanopartikel in die Mischung aus Proben- und Testreagenzien in der Messkammer abhängt. Diese heißen Elektronen beschleunigen die nukleophile Reaktion im Polymerisationsschritt der Amplifikation, was wiederum zur markierungsfreien pH-abhängigen Farbumwandlung von Phenolrot von Fuchsia nach Gelb führt (Abb. 1b). Wir fanden heraus, dass plasmonische Oberflächen mit Nanopartikeln mit einem Durchmesser von 400 nm eine stärkere Verstärkung des elektromagnetischen Feldes und damit verbundene plasmonische Hot-Spot-Katalyseeffekte bieten als plasmonische Oberflächen mit anderen Nanopartikelgrößen, was im Durchschnitt zu einer 9-fachen Beschleunigung der Amplifikationsreaktionsrate führt.

Wir haben das QolorEX-System anhand verschiedener Atemwegsviren und -bakterien validiert. Wir haben auch gezeigt, dass QolorEX zwischen SARS-CoV-2-(Sub-)Varianten auf der Ebene des Einzelnukleotidpolymorphismus unterscheiden kann. Darüber hinaus verfügt QolorEX über eine Nachweisgrenze von 5 RNA-Kopien pro Mikroliter, was eine genaue Diagnose ab Beginn der Infektion bei geringer Viruslast ermöglicht. Wir haben außerdem 33 SARS-CoV-2-positive und 15 negative menschliche Speichelproben getestet. Für diese Proben erreichte QolorEX eine Zeit von der Probe bis zur Antwort von 13 Minuten mit einer Genauigkeit von 95 %, was mit dem quantitativen Goldstandard-PCR-Test vergleichbar ist. Die begrenzte Benutzerbeteiligung, die hohe Genauigkeit, Empfindlichkeit, Automatisierung und Schnelligkeit von QolorEX bedeuten, dass diese Technik den Bedarf an PCR-Tests in entfernten Umgebungen decken könnte.

QolorEX ist wirklich eine vielseitige Plattform. Obwohl wir es mit kolorimetrischen LAMP- und RCA-Assays getestet haben, könnte es möglicherweise mit jedem kolorimetrischen Nukleinsäureamplifikationsassay funktionieren. Darüber hinaus kann QolorEX jedes Nukleinsäureziel erkennen und ist nicht nur auf Viren und Bakterien beschränkt. Zukünftig könnte QolorEX in verschiedene Amplifikationstests integriert oder zur Untersuchung neuer Anwendungen wie Umweltstudien, Lebensmitteltests sowie der Entdeckung und Wirksamkeitsbewertung von Arzneimitteln verwendet werden.

Derzeit erfordert QolorEX klare Probenmedien, um die kolorimetrische Signalerkennung zu ermöglichen. Daher ist eine weitere Entwicklung erforderlich, um die Einbeziehung und Prüfung undurchsichtiger Medien wie Vollblut- und Stuhlproben zu ermöglichen. Darüber hinaus verwendet der aktuelle Ansatz pH-empfindliche Farbstoffe für die kolorimetrische Auslesung, was den pH-Bereich der Proben, die getestet werden können, einschränkt.

Tamer AbdElFatah, Mahsa Jalali und Sara Mahshid

McGill University, Montreal, Quebec, Kanada.

„Diese Arbeit stellt ein umfassendes Paket dar, das Mikrofluidik, Elektronik und nanoplasmonische Transduktionsmechanismen mit einer robusten Laborbewertung des Geräts unter Verwendung mehrerer klinisch relevanter Viren und Bakterien kombiniert.“ Die Autoren nutzen die Bioassay-Studie, um innerhalb von Minuten erfolgreich zwischen bakteriellen und viralen Infektionen zu unterscheiden, eine Anwendung, die sowohl wichtig als auch äußerst schwierig zu erreichen ist.“ Nikhil Bhalla, Universität Ulster, Belfast, Großbritannien.

Anfang 2020 diskutierten wir die Idee einer plasmonisch verbesserten kolorimetrischen Auslesung und die Integration mit der Mikrofluidik. Es war während des Lockdowns, als wir zum ersten Mal auf RT-LAMP-Assays stießen und auf die Idee kamen, eine plasmonisch verstärkte kolorimetrische Auslesung zu verwenden, um die Diagnose von COVID-19 zu erleichtern. Von Anfang an erreichten wir schnellere Nachweiszeiten und niedrigere Nachweisgrenzen als bei der ursprünglichen Arbeit3! Wir wussten jedoch nicht, woher diese Verbesserung kam. Sechs Monate lang haben wir die Literatur verschiedener Disziplinen durchforstet. Eines Tages, T.AF. stieß auf eine Studie über die nukleophile Reaktion, die während der DNA-Amplifikation auftritt5. Erst am Vortag hatten wir die Idee der Elektroneninjektion von der Oberfläche der plasmonischen Materialien unter Lichtanregung diskutiert. Wir fragten uns, ob injizierte Elektronen die Verstärkungsreaktion beschleunigen könnten. Um diese Hypothese zu bestätigen, waren viele experimentelle Validierungen erforderlich. Dennoch werden wir dieses Gefühl nie vergessen, als alles zusammenpasste. T.AF., MJ und SM

„Die Arbeit von AbdelFatah et al. präsentiert ein Tischpaket, das nanoplasmonische Transduktion, Mikrofluidik und eine kolorimetrische Signalauslesung für Smartphones mit quantitativer Ausgabe kombiniert und einen Schritt in Richtung der Entwicklung einer automatisierten modularen molekulardiagnostischen Plattform darstellt. Darüber hinaus zeigt die Studie die robuste Unterscheidung zwischen klinisch relevanten pathogenen Viren und Bakterieninfektionen innerhalb von Minuten und eröffnet Möglichkeiten für den Einsatz und die Einführung solcher Technologien in Umgebungen mit begrenzten Ressourcen.“ Raghavendra Palankar, Mitherausgeber, Nature Nanotechnology.

Wang, C. et al. Point-of-Care-Diagnostik für Infektionskrankheiten: Von Methoden zu Geräten. Nano Today 37, 101092 (2021). Ein Übersichtsartikel, der verschiedene Point-of-Care-Diagnosetests vorstellt.

Artikel CAS Google Scholar

Peeling, RW, Heymann, DL, Teo, YY & Garcia, PJ Diagnostik für COVID-19: Übergang von der Pandemiereaktion zur Kontrolle. Lancet 399, 757–768 (2022). Ein Übersichtsartikel, der diagnostische Tests für SARS-Cov-2 vorstellt.

Artikel CAS Google Scholar

Yu, L. et al. Schneller Nachweis des COVID-19-Coronavirus mithilfe einer RT-LAMP-Diagnoseplattform (Reverse Transcriptional Loop-Mediated Isothermal Amplification). Klin. Chem. 66, 975–977 (2020). In diesem Artikel wird über die Entwicklung eines kolorimetrischen RT-LAMP-Assays zum schnellen Nachweis von SARS-CoV-2 berichtet.

Artikel Google Scholar

Brongersma, ML, Halas, NJ & Nordlander, P. Plasmoninduzierte Wissenschaft und Technologie heißer Träger. Nat. Nanotechnologie. 10, 25–34 (2015). Ein Übersichtsartikel, der plasmoneninduzierte heiße Ladungsträger und ihre Anwendungen, einschließlich der Ansteuerung chemischer Reaktionen, vorstellt.

Artikel CAS Google Scholar

Kottur, J. & Nair, DT Die Pyrophosphathydrolyse ist ein intrinsischer und kritischer Schritt der DNA-Synthesereaktion. Nukleinsäuren Res. 46, 5875–5885 (2018). In diesem Artikel wird über eine eingehende Untersuchung der Nukleinsäureamplifikationsreaktion berichtet.

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Dies ist eine Zusammenfassung von: AbdElFatah, T. et al. Die nanoplasmonische Amplifikation in der Mikrofluidik ermöglicht eine beschleunigte kolorimetrische Quantifizierung von Nukleinsäure-Biomarkern von Krankheitserregern. Nat. Nanotechnologie. https://doi.org/10.1038/s41565-023-01384-5 (2023).

Nachdrucke und Genehmigungen

Nanoplasmonische Beschleunigung der Nukleinsäureamplifikation zum Nachweis von Krankheitserregern. Nat. Nanotechnologie. 18, 846–847 (2023). https://doi.org/10.1038/s41565-023-01398-z

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Veröffentlicht: 05. Juni 2023

Ausgabedatum: August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41565-023-01398-z

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