Phosphormangel induziert die sexuelle Fortpflanzung beim Dinoflagellaten Prorocentrum cordatum

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 14191 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Stickstoff (N) und Phosphor (P) sind wesentliche Elemente, deren Verfügbarkeit das erfolgreiche Wachstum von Phytoplankton fördert und die aquatische Primärproduktivität steuert. In dieser Studie untersuchten wir die Auswirkung von N- und/oder P-Mangel auf die sexuelle Fortpflanzung von Prorocentrum cordatum, dem Dinoflagellaten mit dem haplontischen Lebenszyklus, der weltweit schädliche Algenblüten verursacht. In P. cordatum-Kulturen führten N und der kombinierte N- und P-Mangel zum Stillstand des Zellzyklus in den G0/G1-Phasen und zur Abschwächung des Zellkulturwachstums. Wir beobachteten, dass P-, nicht aber N-Mangel den Übergang im Lebenszyklus von P. cordatum vom vegetativen zum sexuellen Stadium auslöste. Dies führte zu einem starken Anstieg des Prozentsatzes von Zellen mit einem relativen Kern-DNA-Gehalt von 2C (Zygoten) und dem Auftreten von Zellen mit einem relativen Kern-DNA-Gehalt von 4C (Teilungszygoten). Die anschließende Ergänzung mit Phosphat stimulierte die Meiose und führte zu einem spürbaren Anstieg der 4C-Zellenzahl (sich teilende Zygoten). Darüber hinaus führten wir eine transkriptomische Datenanalyse durch und identifizierten mutmaßliche Phosphattransporter und Enzyme, die an der Phosphataufnahme und der Regulierung seines Metabolismus durch P. cordatum beteiligt sind. Dazu gehören hoch- und niedrigaffine anorganische Phosphattransporter, atypische alkalische Phosphatasen, violette saure Phosphatasen und SPX-Domänen enthaltende Proteine.

Dinoflagellaten sind eine der wichtigsten Gruppen von Protisten, die zur marinen Primärproduktion, zum Stoff- und Energietransfer innerhalb der aquatischen Nahrungsketten und zur weltweiten Bildung schädlicher Algenblüten, auch „Rote Fluten“ genannt, beitragen1, 2. Diese Mikroalgen haben einen Komplex Lebenszyklus mit Veränderung der vegetativen und transienten Sexualstadien. Mit der einzigen bekannten Ausnahme von Noctiluca3 haben typische Dinoflagellaten einen haplontischen Lebenszyklus. Unter bestimmten Umweltbedingungen differenzieren sich vegetative Zellen in Gameten, die verschmelzen und eine diploide Zygote bilden. Letztere bildet entweder eine sexuelle Ruhezyste oder durchläuft zwei aufeinanderfolgende meiotische Teilungen ohne langfristige Einkapselung. Während der Keimung durchlaufen sexuelle Ruhezysten eine Meiose4,5,6.

Die Suche nach Faktoren, die den Übergang vom vegetativen zum sexuellen Stadium des Lebenszyklus regulieren, ist seit mehreren Jahrzehnten Gegenstand der Forschung. Bei einigen Arten kann dieser Übergang spontan erfolgen3, 7. Wie bei vielen anderen Protisten wird Sex bei Dinoflagellaten jedoch als Überlebensstrategie unter widrigen Umweltbedingungen wie Nährstoffmangel, ungünstigem Temperaturregime, Salzgehaltstress, Beweidung oder Parasitenbefall angesehen Infektion8,9,10,11. Die Wechselwirkungen zwischen den Faktoren, die Sexualität auslösen, können komplex sein. Bei Alexandrium minutum beispielsweise erhöht die kombinierte Wirkung von drei Faktoren, wie P-Mangel, niedriger Salzgehalt und hohe Temperatur, die Ausbeute an Planozygoten und sexuellen Ruhezysten im Vergleich zur Wirkung des einzigen P- und/oder N-Mangels erheblich9 . Die Anwesenheit eines geeigneten Paarungspartners ist auch für eine erfolgreiche sexuelle Fortpflanzung bei heterothallischen Arten wichtig12. Für viele Dinoflagellaten wurde der Sexualprozess in späten exponentiellen oder stationären Kulturen beschrieben, die durch eine hohe Zellkonzentration und eine Erschöpfung der Nährstoffquellen gekennzeichnet sind13,14,15. Bei heterotrophen Arten wie Polykrikos kofoidii kann das Fehlen von Beute auch die Bildung von Gameten induzieren7. Tatsächlich dürfte die Nährstoffverfügbarkeit eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der Lebenszyklen dieser Gruppe von Protisten spielen. In Kulturen der meisten Dinoflagellaten kann Sexualität durch Senkung oder Eliminierung von N und/oder P oder durch Änderung ihres Verhältnisses im Kulturmedium induziert werden8, 16.

Prorocentrum cordatum (derzeit als taxonomisches Synonym für Prorocentrum Minimum anerkannt) ist ein neritischer planktonischer Dinoflagellat und der Erreger schädlicher Algenblüten auf der ganzen Welt17,18,19,20,21. Der Lebenszyklus von P. cordatum wurde kürzlich beschrieben22. In der alternden Kultur, die mehr als drei Wochen lang ohne Zugabe von frischem Medium und Nährstoffen wuchs, wurden verschiedene sexuelle Stadien wie die Verschmelzung von Gameten, Planozygoten und Zygoten, die sich durch Meiose teilen, beobachtet. Über die spezifischen Faktoren, die einen Übergang von der vegetativen Fortpflanzung zur Sexualität auslösen, wurde bisher jedoch nicht berichtet. Wir vermuten, dass N- und/oder P-Mangel die sexuelle Fortpflanzung bei P. cordatum auslösen kann.

Da der Übergang vom vegetativen Stadium des Lebenszyklus zum sexuellen Stadium in erster Linie durch Nährstoffknappheit reguliert wird, können molekulare Transporter und Enzyme, die an der N- und P-Aufnahme und den ersten Schritten ihres Stoffwechsels beteiligt sind, an der Signalübertragung aus der Umwelt und der Regulierung beteiligt sein des Lebenszyklus. Die an der N-Akquisition beteiligten Transporter und Enzyme wurden in früheren Arbeiten in P. cordatum aufgelistet und charakterisiert. Dabei handelt es sich um DUR3 und das Major Intrinsic Protein (MIP), das am Harnstofftransport, dem Nitrattransporter NRT2, der Urease, der assimilatorischen Nitratreduktase NR und der Nitritreduktase NIR23,24,25,26 beteiligt ist. Über die molekulare Maschinerie, die an der P-Akquisition beteiligt ist, ist jedoch wenig bekannt. Das einzige gut charakterisierte Enzym ist die alkalische Phosphatase (AP), die anorganisches Phosphat (Pi) aus verschiedenen Arten von Phosphoestermolekülen freisetzt. Bei Dinoflagellaten ist AP eine wichtige Zelloberflächenhydrolase, die die Nutzung von gelöstem organischem Phosphor (DOP) ermöglicht, wenn Pi knapp ist. Sequenzvergleiche und phylogenetische Analysen von Dinoflagellaten-APs ergaben, dass sie einen atypischen AP-Typ – PhoAaty – umfassen, der denen ähnelt, über die in Proteobakterien, Cyanobakterien, Grünalgen, Haptophyten und Stramenopiles berichtet wurde27. Bei P. cordatum nehmen die Expression und Aktivität dieses Enzyms in einer P-limitierten Umgebung zu28, 29. Interessanterweise nimmt bei einigen Dinoflagellaten, zum Beispiel bei Karenia brevis und Alexandrium catenella, die funktionelle Aktivität von AP, jedoch nicht die Expression, unter P-Mangel zu30,31 ,32.

Eukaryontische Mikroorganismen besitzen Pi-Transporter mit niedriger Affinität, die bei hohen Pi-Konzentrationen funktionieren, und Pi-Transporter mit hoher Affinität, die bei Pi-Mangel hochreguliert werden. Die Pi-Transporter mit niedriger Affinität unterteilen sich in die Pi-Transporter IPT und die Natrium- oder Sulfat-abhängigen Pi-Transporter SPT. Lin und Co-Autoren33 systematisierten das Wissen über P-Transporter im eukaryotischen Phytoplankton und führten ein Screening mehrerer Dinoflagellaten-Transkriptome durch, um Sequenzen mutmaßlicher Pi-Transporter zu finden. Es wurden Homologe von Pi-Transportern mit hoher und niedriger Affinität, einschließlich SPT, gefunden. Allerdings enthält keines dieser Transkriptome einen vollständigen Satz dieser Transporter33.

In dieser Studie haben wir uns im Wesentlichen auf zwei grundlegende Fragen konzentriert: Reguliert Nährstoffmangel den Lebenszyklus von P. cordatum und welche molekularen Mechanismen können an diesem Prozess beteiligt sein? Wir untersuchten, wie sich die Abwesenheit von N und/oder P auf das Kulturwachstum sowie die Zell- und Lebenszyklen auswirkt. Unsere Ergebnisse zeigten, dass P-Mangel einen Übergang vom vegetativen Stadium zum sexuellen Stadium auslöst. Um diese Mechanismen weiter zu beleuchten, haben wir öffentlich verfügbare Transkriptome von P. cordatum gescreent, Schlüsselgene aufgelistet, die an der P-Aufnahme beteiligt sind, und vermutet, dass einige von ihnen an der Regulierung des Lebenszyklus beteiligt sein könnten.

Kontroll- und P-defiziente Kulturen zeigten bis zum 15. Tag ähnliche Wachstumsraten (Abb. 1a, Tabelle 1). Die P-defiziente Kultur erreichte innerhalb von 15 Tagen ein Plateau mit einer maximalen Biomasse von 1,66 × 105 Zellen ml–1, während sich die Kontrollzellen bis zum 18. Tag weiter teilten und am Ende des Experiments eine Zelldichte von 2,09 × 105 Zellen ml–1 erreichten. Das Wachstum von N- und NP-defizienten Kulturen war von Anfang an beeinträchtigt und der Unterschied wurde innerhalb von 9 Tagen beträchtlich, als die Zellkonzentrationen in N- und NP-defizienten Kulturen 1,06 × 105 bzw. 1,09 × 105 Zell-ml–1 erreichten in den Kontroll- und P-defizienten Kulturen betrugen sie 1,29 × 105 bzw. 1,35 × 105 Zell-ml–1. Die maximale Biomasse in Kulturen ohne N- und NP-Mangel betrug am 21. Tag nur 1,35 × 105 Zellen ml–1 (Abb. 1a).

Wachstumskurven (a), Nitrat- und Phosphatkonzentrationen (b,c) in den P. cordatum-Kulturen unter den Kontroll-, N-, P- und NP-limitierten Bedingungen über den 21-tägigen Versuchszeitraum. Die angezeigten Daten sind Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts (a) und Standardabweichungen (b, c) für die dreifachen Experimente.

In der Kontrolle sanken die Nitrat- und Phosphatkonzentrationen bis zum Ende des Experiments allmählich von 630 auf 72 µM bzw. von 37 auf 2 µM (Abb. 1b, c). In Kulturen mit N- und NP-Mangel war Nitrat ab dem 6. Tag nicht mehr nachweisbar. Die Nitrataufnahme war in der Kultur mit P-Mangel im Vergleich zur Kontrolle deutlich beeinträchtigt (Abb. 1b). In P- und NP-armen Kulturen fiel die Phosphatkonzentration im Wachstumsmedium innerhalb von 9 Tagen unter die Nachweisgrenze. Die Phosphataufnahme war in der Kultur ohne N deutlich reduziert (Abb. 1c).

Der Anteil der Zellen mit einem relativen DNA-Gehalt von 1C → 2C (S-Phase) um 5:00 Uhr (maximale erwartete Zellzahl während der S-Phase) korrelierte mit der berechneten spezifischen Wachstumsrate in allen Kulturen (Tabelle 1). In der Kontrollgruppe sank die Anzahl der Zellen im 1C → 2C-Stadium allmählich von 26 % am Tag 6 auf 8 % am Ende des dreiwöchigen Experiments. In der P-defizienten Kultur nahm der Prozentsatz der 1C → 2C-Zellen bis zum 15. Tag mit der gleichen Geschwindigkeit ab wie in der Kontrolle, dann ging die Anzahl der Zellen in der S-Phase nahe Null. In N- und NP-defizienten Kulturen sank der Prozentsatz der Zellen in der S-Phase bis zum 12. Tag auf unter 5 % (Abb. 2a). Um 21:00 Uhr (erwartete minimale Zellzahl während der S-Phase) war der Prozentsatz der Zellen in der S-Phase in allen Experimenten niedrig und die Änderungen dieses Anteils während des Experiments waren vernachlässigbar.

Prozentsatz der Zellen mit relativem Kern-DNA-Gehalt 1C, 1C → 2C und 2C während des 21-tägigen Versuchszeitraums um 5:00 und 21:00 Uhr. (a) Prozentsatz der Zellen mit einem relativen Kern-DNA-Gehalt von 1C → 2C (S-Phase des Zellzyklus). (b) Prozentsatz der Zellen mit relativem Kern-DNA-Gehalt 1C (G0/G1-Phase). (c) Prozentsatz der Zellen mit relativem Kern-DNA-Gehalt 2C (G2/M-Phase und Zygoten). Dargestellt sind Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts aus den dreifachen Experimenten.

In der Kontrolle um 5:00 Uhr, in N-defizienten und NP-defizienten Kulturen, stieg der Zellanteil im 1C-Stadium leicht von 6 auf 9 Tage (Abb. 2b), entsprechend der Abnahme des Anteils von 1C → 2C-Zellen (Abb. 2a). Die Anzahl der 2C-Zellen veränderte sich nicht signifikant und betrug während des gesamten Experiments etwa 10 % in der Kontrolle und 3–5 % in N-defizienten und NP-defizienten Kulturen (Abb. 2c).

In einer Kultur mit P-Mangel stieg der Prozentsatz der Zellen mit dem relativen DNA-Gehalt 2C deutlich von 5–8 % am 9. Tag auf 22–32 % am 12. Tag und erreichte innerhalb von 15 Tagen ein Plateau von ~ 45 % (Abb. 2c). Der Anteil der 1C-Zellen nahm mit dem Anstieg des Anteils des 2C-Stadiums ab (Abb. 2b). Überraschenderweise erschien ab dem 12. Tag eine kleine Fraktion von Zellen mit dem relativen DNA-Gehalt 2C → 4C und 4C und erreichte am 21. Tag 3 % bzw. 7 % (Suppl. Abb. 1, 2).

Wir vermuten, dass die Zellen mit dem relativen Kern-DNA-Gehalt 2C und 4C die sexuellen Stadien sind, und gingen davon aus, dass die Zugabe von Nährstoffen die Meiose stimulieren und in den anfänglichen vegetativen Zustand zurückkehren kann. Nach Zugabe des f/2-Mediums, das die erforderliche Konzentration an Nitrat und Phosphat enthielt, waren die Veränderungen im Verhältnis der Zellen mit unterschiedlichem DNA-Gehalt um 5:00 Uhr am deutlichsten. In der Kultur ohne Phosphor verdoppelte sich der Anteil des 4C-Stadiums um 5:00 Uhr innerhalb von 24 Stunden mehr als und erreichte 15 %. Darüber hinaus stieg der Anteil der 1C → 2C-Zellen am ersten Tag stark von 1,3 auf 27 % an. Innerhalb von drei Tagen nahmen die Anteile der 4C- und 2C → 4C-Stadien deutlich ab und verschwanden am fünften Tag, als der Anteil der Zellzyklusstadien nicht mehr unterscheidbar war von der Steuerung. Nach Zugabe des frischen Mediums zur Kontrollkultur verdoppelte sich auch der Anteil der 1C → 2C-Zellen innerhalb von 24 Stunden, kehrte jedoch nach 3 Tagen auf die Ausgangswerte zurück. Ähnliche, aber weniger ausgeprägte Trends wurden um 21:00 Uhr sowohl in der Kontrollkultur als auch in der Kultur ohne Phosphor beobachtet (Abb. 3).

Prozentsatz der Zellen in den verschiedenen Phasen des Zellzyklus nach 21 Tagen P-Mangel-Kulturen und 1, 3 und 5 Tagen nach Zugabe von frischem Medium.

Da Phosphormangel zu einer Verschiebung des Lebenszyklusfortschritts von P. cordatum führt, haben wir uns auf die Suche nach Proteinen konzentriert, die für die Phosphataufnahme in öffentlich zugänglichen Transkriptomen verantwortlich sind. Als Abfragen wurden kommentierte Sequenzen der knospenden Hefen Saccharomyces cerevisiae, der höheren Pflanze Arabidopsis thaliana und des Haptophyten Emiliania huxleyi verwendet. Die vollständige Liste der Abfragen, ihrer Funktionen und Sequenzen in P. cordatum ist in Tabelle 2 aufgeführt.

Das pho84-Gen kodiert einen hochaffinen H+-Phosphat-Symporter in S. cerevisiae, der zur Major Facilitator Superfamilie (MFS) gehört. Wir fanden 16 Sequenzen von 12 Homologen in zwei Transkriptomen von P. cordatum, die signifikante Alignments mit einem e-Wert von weniger als e–10 erzeugten. Fünf Homologe (8 Sequenzen in zwei Transkriptomen) enthielten das glycinreiche Phosphatbindungsmotiv GXGXGG, das von protonengekoppelten Phosphattransportern in Pflanzen, Pilzen, Bakterien und Säugetieren geteilt wird (Suppl. Abb. 3)34. Diese Sequenzen wurden in die endgültige Liste der Homologen aufgenommen (Tabelle 2). Außerdem wurden die Sequenzen auf das Vorhandensein konservativer Motive protonengekoppelter Transporter pflanzlichen und pilzlichen Ursprungs analysiert, die durch das Motivbildungsprogramm MEME35 generiert wurden. Drei von fünf Motiven wurden in Homologen von P. cordatum gefunden (Suppl. Abb. 3). Darüber hinaus sind in P. cordatum-Homologen Stellen vorhanden, die S. cerevisiae Arg168, Asp358 und Lys492 entsprechen und sich als entscheidend für die Transportfunktion in PHO84 erwiesen haben. Wir haben auch fünf Phosphattransporter mit niedriger Affinität gefunden, die homolog zu PHO90, PHO91 und PHO87 der Hefe sind. Es ist zu beachten, dass diese Proteine in Hefen die SPX-Domäne enthalten, diese jedoch in P. cordatum-Homologen fehlt.

Alkalische Phosphatase (AP) ist eine Hydrolase, die Pi aus organischen Molekülen freisetzt. Für die Suche nach den APs haben wir die Sequenz des Haptophyten E. huxleyi als Abfrage verwendet, der atypische AP-PhoAaty darstellt. Wir fanden in jedem vorhandenen Transkriptom von P. cordatum einzelne Sequenzen mit starker Homologie (E-Wert = 0). Purpursaure Phosphatasen (PAPs) – die Mitglieder der Metallophosphoesterase-Familie – können auch für die Pi-Freisetzung aus den Phosphatmonoestern wichtig sein. Unter Verwendung der Aminosäuresequenz von A. thaliana PAP15 (GenBank-ID: AEE74502.1) als Abfrage für zwei P. cordatum-Transkriptome wurden 12 mutmaßliche PAP-Homologe ermittelt (Tabelle 2). Wir führten mithilfe des ClustalO-Algorithmus ein Mehrfachsequenz-Alignment aller P. cordatum-PAP-Homologen mit PAP11 und PAP12 von A. thaliana durch und stellten fest, dass alle fünf von Schenk und Co-Autoren erwähnten konservativen Motive in P. cordatum-PAPs vorhanden sind (Suppl. Abb. 4). .

Wir haben außerdem fünf SPX-Domänen enthaltende Sequenzen in zwei Transkriptomen von P. cordatum entdeckt. Als wir das A. thaliana SPX-Domänen enthaltende Protein 1 als Abfrage verwendeten, war die Sequenzhomologie zu niedrig (E-Wert kleiner als e–10). Daher haben wir das Vorhandensein der SPX-Domäne mithilfe der NCBI Conserved Domain Search-Datenbank und PROSITE erneut überprüft. Unter den abgerufenen Sequenzen gibt es eine, die die SPX-Domäne als einzige funktionale Domäne enthält. Zwei SPX-haltige Homologe (vier Sequenzen) besitzen eine vakuoläre Transporter-Chaperon-Domäne (VTC). Einer von ihnen (CAMPEP_0191116404 und CAMPEP_0191031170) weist eine starke Homologie (E-Wert = 5e–60) zu einer katalytischen S. cerevisiae-Untereinheit VTC4 des VTC-Komplexes auf. Darüber hinaus haben wir ein potenzielles Mitglied der PHO1-Genfamilie (CAMPEP_0191052604) gefunden, das sowohl SPX- als auch EXS-Domänen enthält (Tabelle 2). In A. thaliana überträgt das PHO1-Protein Pi von den epidermalen und kortikalen Zellen zu den Wurzelxylemgefäßen.

Entsprechend ihrem physiologischen Bedarf beginnen und entwickeln sich Dinoflagellatenblüten unter günstigen Bedingungen, wenn reichlich Nährstoffe vorhanden sind. In diesem Zeitraum vermehren sich Dinoflagellaten vegetativ. Während der Spitzenblüte, wenn die Nährstoffquellen erschöpft sind, aber die Algenkonzentration hoch ist, beginnen einige Zellen mit der Gametenbildung und produzieren sexuelle Ruhezysten, die zu Boden sinken, und die Blüte endet auf diese Weise5. Jüngste Studien ergaben, dass Meiose-Gene auch während der Blüteverlängerung exprimiert werden, was darauf hindeutet, dass Dinoflagellaten die Meiose nicht nur zur Enzystierung, sondern auch zur Zellproliferation nutzen37. Dennoch gelten Nährstoffmangel, insbesondere N- und P-Limitierungen, als die wirksamsten Faktoren zur Auslösung der sexuellen Fortpflanzung bei Dinoflagellaten8, 16. In dieser Studie haben wir die Rolle der N- und P-Limitierung bei Zell- und Lebenszyklusveränderungen bei P. nachgewiesen. cordatum und fasste es in Abb. 4 zusammen.

Schematische Darstellung der Veränderungen des intrazellulären DNA-Gehalts im Lebenszyklus des Dinoflagellaten P. cordatum.

Sowohl die Menge als auch die Qualität der Nährstoffe beeinflussen den Zellzyklus der Dinoflagellaten und damit die Wachstumsrate dieser Protisten. Der Hell-Dunkel-Zyklus hat eine starke Kontrolle über die Phasen des Zellzyklus in photosynthetischen Dinoflagellaten. Der Zeitpunkt der S-Phase und der Mitose wird durch die Manipulation von Nährstoffen nicht verändert, ein N- und P-Mangel im Kulturmedium kann jedoch zu einer Verlängerung der S-Phase in P. cordatum-Zellen führen38, 39. Der Rückgang von P. Die Cordatum-Proliferation in nährstoffarmen Kulturen wurde auch in früheren Studien gezeigt40, 41. In der aktuellen Arbeit wurde das Wachstum im Vergleich zum P-Mangel am stärksten durch N-Mangel beeinflusst. Die Anzahl der Zellen, die in die S-Phase eintreten, nahm zusammen mit der Nährstoffverarmung ab, was gut mit der verringerten Wachstumsrate korreliert. Ein Mangel an einem Nährstoff kann sich negativ auf die Aufnahme eines anderen auswirken. Unsere Ergebnisse stimmen mit den früheren Beobachtungen von Li und Co-Autoren überein, da wir gezeigt haben, dass die P-Limitierung die N-Aufnahme und -Assimilation negativ beeinflusst und alternativ ein niedriges N:P-Verhältnis zu einer N-Limitierung der P-Aufnahme in P. cordatum führte.

Mehrere Studien untersuchten die physiologischen Reaktionen von P. cordatum auf sich ändernde N:P-Verhältnisse und N- und P-Mangel. Der Mangel an N und P führt zu einem Anstieg des intrazellulären C:N-Verhältnisses, das in Kulturen ohne N-Mangel stärker ausgeprägt ist24, 40, 41, was offenbar mit der Akkumulation neutraler Lipide und Stärke im Zytoplasma zusammenhängt wurde in der verwandten Art Prorocentrum lima42 gezeigt. Unter P-Limitierung nimmt die Effizienz der Photosynthese ab41. Außerdem stimuliert ein Mangel an P, nicht jedoch an N, P. cordatum dazu, die fehlenden Nährstoffe aus organischen Quellen zu beziehen, wodurch Phagozytose induziert und die Expression und Aktivität der alkalischen Phosphatase erhöht wird43, 44. Allerdings wurde in keiner dieser Studien auf Veränderungen im Lebenszyklus geachtet. Dies könnte auf die Tatsache zurückgeführt werden, dass Gameten die gleiche Morphologie wie vegetative Zellen besitzen und nur durch „Paarungsverhalten“ – Paarung und Umeinanderwirbeln – unterschieden werden können. Auf der lichtoptischen Ebene ähneln fusionierende Gameten vegetativen Zellen, die eine mitotische Teilung durchlaufen. Darüber hinaus produziert P. cordatum keine sexuellen Ruhezysten, die bei zystenbildenden Arten als entscheidender Marker für das Geschlecht dienen22. Eine Verschlechterung des Kulturwachstums und bestimmte physiologische Veränderungen, wie z. B. eine durch Nährstoffeinschränkung verursachte Abnahme der Photosyntheseeffizienz, können nicht nur mit dem Stillstand des Zellzyklus in der G0/G1-Phase verbunden sein; Dies könnte auf die Differenzierung einiger Zellen in Gameten und die anschließende Zygotenbildung zurückzuführen sein. Daher ist es sinnvoll, in den Experimenten mit Nährstoffmangel Veränderungen im relativen intrazellulären DNA-Gehalt in den Zellen zu beobachten.

Die durchflusszytometrische Analyse einer P. cordatum-Kultur mit P-Mangel ergab einen signifikanten Anstieg der Zellfraktion mit einem relativen Kern-DNA-Gehalt von 2C am 15. Tag des Experiments. Dieses Phänomen kann durch einen Übergang des Lebenszyklus in die sexuelle Phase, die Gametenproduktion und das Auftreten von 2C-Zygoten erklärt werden. Diese Hypothese wird durch das gleichzeitige Auftreten der 4C-Zellfraktion bestätigt, was darauf hindeutet, dass Zygoten eine Meiose durchlaufen. Ähnliche Ergebnisse wurden in A. minutum-Kreuzkulturen erzielt, bei denen in einem P-limitierten Medium ein signifikanter Anteil an 4C-Zellen auftrat, was auf eine sexuelle Fortpflanzung hinweist. Gleichzeitig nahm die Zahl der sexuellen Ruhezysten in solchen Kulturen zu45. Darüber hinaus wurden 2C → 4C- und 4C-Zellen während der Blüte von Prorocentrum shikokuense und Karenia mikimotoi gefunden. Das Metatranskriptom-Profiling bestätigte die sexuelle Fortpflanzung, indem es eine Überexpression der Meiose-Gene in diesen Dinoflagellaten zeigte37.

Mit der Entwicklung von Sequenzierungstechnologien und deren Kostensenkung konzentrierte sich eine beträchtliche Anzahl von Studien auf die Transkriptionsregulation bei N- oder P-Mangel bei Dinoflagellaten. Diesen Studien zufolge schienen die am Sexualprozess beteiligten Gene nicht überexprimiert zu sein. Es sollte jedoch beachtet werden, dass viele Dinoflagellaten, zum Beispiel A. minutum, komplexe heterothallische Paarungstypen aufweisen und einen geeigneten genetisch divergierenden Sexualpartner benötigen46. Bei dieser Art kann der Sexualprozess durch eine Senkung der N- und/oder P-Konzentrationen induziert und durch eine Verringerung des Salzgehalts und eine Temperaturerhöhung verstärkt werden9. Die transkriptomische Analyse der N- und P-armen A. minutum-Kultur ergab eine lange Liste von Genen, die an der Geschlechtsbestimmung, Geschlechtsdifferenzierung und Paarung beteiligt sind und nach 6 Stunden Hunger unterschiedlich exprimiert wurden. Die meisten dieser Unigene kehrten jedoch nach 72-stündiger Nährstoffmangelexposition zum normalen Expressionsniveau zurück47. Diese Studie legt nahe, dass die N- und P-Limitierung zwar die sexuelle Fortpflanzung bei A. minutum induziert, das Fehlen geeigneter Paarungspartner diesen Prozess jedoch unterdrücken würde. Ein weiteres Beispiel ist der giftige, blütenbildende Dinoflagellat K. brevis, der ebenfalls heterothallisch ist. Es wurde gezeigt, dass ein Mangel an N die sexuelle Fortpflanzung und die Bildung ruhender Zysten bei diesem Protisten induziert.48, 49. Eine Microarray-Analyse der transkriptomischen Reaktion ergab, dass weder ein N-Mangel noch eine anschließende N-Zugabe die Expression von Meiose-Genen induzierten31. Dieses Ergebnis kann durch die Tatsache erklärt werden, dass die Studie an einer Batch-Kultur ohne Geschlechtskreuzungen durchgeführt wurde.

Der Wechsel von einem erschöpften Medium zu einem frischen, nährstoffreichen Medium führt zur Keimung von Sexualzysten und zur Meiose bei zystenbildenden Dinoflagellaten37. In unseren Experimenten erhöhte die Zugabe von frischem f/2-Medium zur hungernden Kultur den Anteil der 4C-Zellen, die im Replikationsstadium Zygoten zu sein scheinen, innerhalb von 24 Stunden, was auf die Induktion meiotischer Teilungen hindeutet. Dieser Zellanteil nahm ab und verschwand 5 Tage nach der Nährstoffzufuhr, was darauf hindeutet, dass sich alle Zygoten teilten und die Zellen in den haploiden Zustand zurückkehrten.

Es bleiben viele Fragen offen, wie P. cordatum das zelluläre P-Gleichgewicht aufrechterhält, insbesondere unter Blütebedingungen, die häufig bei höheren N:P-Nährstoffverhältnissen als Redfield auftreten50. Wir führten eine transkriptomische Datenanalyse durch und erhielten eine Liste der Gene, die möglicherweise an der P-Aufnahme und ihrer Regulierung in P. cordatum beteiligt sind. Das Vorhandensein sowohl von Pi-Transporter-Homologen mit niedriger Affinität als auch von Pi-Transporter-Homologen mit hoher Affinität bedeutet, dass P. cordatum die P-Aufnahme abhängig von der Pi-Konzentration in der Umgebung effektiv regulieren kann. Überraschenderweise fanden wir ein Homolog des PHO1-Proteins, das Pi aus epidermalen und kortikalen Wurzelzellen in die Xylemgefäße höherer Pflanzen transportiert.51, 52. Dieser Pi-Exporter kann auch an der Regulierung der P-Homöostase in P. cordatum beteiligt sein.

Gelöster organischer Phosphor ist die Hauptquelle für P während der Blüte, insbesondere in einer Umgebung mit Pi-Mangel. Dinoflagellaten können effektiv auf verschiedenen phosphorhaltigen organischen Molekülen wachsen, wie ATP, Cytidin-5-monophosphat, Fructose-6-phosphat, Glucose-6-phosphat, Glycerophosphat, Uridin-5-monophosphat, Phenylphosphat, RNA usw.38, 39, 53, 54. Das Schlüsselenzym, das die Freisetzung von Pi aus den Phosphoestern ermöglicht, ist AP PhoA auf der Zelloberfläche. Dinoflagellaten-AP-Proteinsequenzen weisen eine hohe Variabilität auf und gehören wahrscheinlich zu einem atypischen Typ namens PhoAaty27. Daher konnten wir P. cordatum AP aufgrund der extrem geringen Ähnlichkeit zwischen ihnen nicht mithilfe der Proteinsequenz von S. cerevisiae AP PHO8 wiederherstellen. Wir mussten also die PhoAaty-Sequenz des Haptophyten Emiliania huxleyi verwenden und fanden bei diesem Versuch in jedem Transkriptom ein P. cordatum-Homolog.

Neben gut untersuchten APs hydrolysieren auch violette saure Phosphatasen (PAPs) organische Phosphatester und fördern die Phosphataufnahme in Pflanzen und Mikroalgen. Es wurde beobachtet, dass in der Kieselalge Phaeodactylum tricornutum die PAP-Expression in Zellen, die auf organischen P-Quellen gezüchtet wurden, im Vergleich zu anorganischen erhöht war55. Es gibt 29 PAPs in A. thaliana, die nach Phylogenie in drei Gruppen eingeteilt werden. Nur zwei Enzyme, AtPAP11 und AtPAP12, werden nachweislich bei Phosphatmangel überexprimiert56. Bei Dinoflagellaten wird PAP in P-armen K. brevis überexprimiert31. In dieser Studie fanden wir 12 mutmaßliche PAP-Homologe in zwei Transkriptomen von P. cordatum, die offenbar verschiedene Rollen bei der Reaktion auf P-Stress spielen. Die Entschlüsselung der Funktionen verschiedener PAP-Homologe im P-Metabolismus ist ein potenziell vielversprechender Bereich für die zukünftige Studie.

SPX-Domänen enthaltende Proteine regulieren die Pi-Homöostase in Pflanzen negativ, indem sie die externen und internen Pi-Spiegel erfassen57. Die Analyse der Transkriptome mariner eukaryotischer Arten (MMETSP-Datensatz) ergab, dass SPX-verwandte Gene in verschiedenen Taxa des Phytoplanktons weit verbreitet sind, was auf ihre universelle Bedeutung hinweist58. In der Kieselalge P. tricornutum wurden zwei Multidomänen-SPX-haltige Proteine identifiziert: der vakuoläre Phosphattransporter (Vpt4), der die vakuoläre Phosphatsequestrierung vermittelt, und der vakuoläre Transporter Chaperon 4 (Vtc4)58. Darüber hinaus gibt es ein SPX-haltiges Protein, das in P. tricornutum die einzige funktionelle SPX-Domäne aufweist. Das Ausschalten dieses Gens führte zu einer signifikanten Hochregulierung der Phosphattransporter Vtc4 und Vpt4 und zu einem Anstieg der Aktivität der alkalischen Phosphatase sowohl in phosphatabgereichertem als auch in P-vervielfachtem Medium, was darauf hindeutet, dass SPX ein negativer Regulator sowohl der P-Aufnahme als auch der P-Stress-Reaktionen ist58 . Im Transkriptom von P. cordatum fanden wir zwei Vtc4-Homologe und eine Sequenz mit SPX als einziger funktioneller Domäne, was darauf hindeutet, dass bei dieser Art die Pi-Homöostase ebenfalls auf ähnliche Weise reguliert werden kann. Dies muss jedoch noch experimentell überprüft werden.

Diese Arbeit erweitert das Wissen über die Regulierung der Lebenszyklen bei den blütenbildenden Dinoflagellaten. Wir haben gezeigt, dass P-Mangel ein Faktor sein kann, der die sexuelle Fortpflanzung bei P. cordatum induziert und so die HAB-Intensität beeinflusst. Die Zugabe von phosphatreichem Medium zu einer P-defizienten Kultur stimulierte die Meiose und die Rückkehr zum haploiden vegetativen Stadium. Die Analyse der Transkriptome ergab, dass P. cordatum über eine Reihe von Proteinen verfügt, die eine effiziente Aufnahme von P aus verschiedenen Quellen (anorganisch und organisch) in der Umgebung mit hoher oder niedriger Phosphatkonzentration ermöglichen. Die zunehmende Häufigkeit schädlicher Dinoflagellatenblüten ist eine der Meeresherausforderungen des 21. Jahrhunderts. Wir glauben, dass ein integrierter Ansatz, der Studien zur Regulierung der Lebenszyklen von Dinoflagellaten in der schwankenden aquatischen Umwelt mit unterschiedlicher Nährstoffverfügbarkeit unter verschiedenen Temperatur- und Salzgehaltsbedingungen umfasst, zur effektiven Vorhersage von Dinoflagellatenblüten und sogar zur Bewältigung des HAB-Problems beitragen kann im großen Maßstab.

Die Kultur des P. cordatum-Stammes CCAP1136/16 (aus The Culture Collection of Algae and Protozoa, UK) wurde in künstlichem f/2-Medium59 auf Meerwasserbasis ohne Zusatz von Kieselsäure gezüchtet. Das Medium wurde durch Autoklavieren sterilisiert und der Salzgehalt auf 25 eingestellt. Die Vitaminmischung wurde durch Sterilfiltration sterilisiert und separat zugegeben. Die Zellen wurden bei 18 °C unter 100 µmol Photonen m–2 s–1 und einem 12-stündigen Licht-/12-stündigen Dunkelzyklus gezüchtet, wobei die Lichtperiode um 09:00 Uhr begann und um 21:00 Uhr endete.

Die 240 ml der Anfangskultur wurden ausgehend von einer Konzentration von 3 × 104 Zellen ml–1 im f/2-Medium mit 176 µM NO3– und 40 µM PO43– 7 Tage lang gezüchtet, um eine Zellkonzentration von ~ 1,2 × 105 Zellen ml zu erreichen –1. Anschließend wurden die Zellen zur Synchronisierung des Zellzyklus 72 Stunden lang in völlige Dunkelheit gebracht. Anschließend wurde die synchronisierte Kultur auf die vier Kolben verteilt und jeder wurde 1:3 mit f/2 verdünnt, ohne Zugabe von NO3–, PO43– oder beiden Nährstoffen (Abb. 5). Die Kontrollkultur wurde mit Medium verdünnt, das 880 µM NO3– und 40 µM PO43– enthielt. Die Versuchskulturen wurden 21 Tage lang gezüchtet. Zelldichte, Nitrat- und Phosphatkonzentrationen wurden gemessen und alle drei Tage wurden Zellproben für die Durchflusszytometrie entnommen. Am 21. Tag wurde frisches f/2-Medium mit 880 µM NO3– und 40 µM PO43– im Verhältnis 1:1 in die Kolben gegeben. Die Kulturen wurden weitere 5 Tage lang gezüchtet; Die Probenahme erfolgte am ersten, dritten und fünften Tag. Das Experiment wurde dreifach durchgeführt.

Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus. Eine synchronisierte Startkultur mit einer Zelldichte von ~ 1,2 × 105 Zell-ml wurde in vier Flaschen aufgeteilt. Jede Portion wurde 1:3 mit f/2-Medium ohne Zusatz von NO3– („-N“), PO43- („-P“) oder beiden Nährstoffen („-NP“) verdünnt. Die Kontrollkultur wurde mit Medium verdünnt, das 880 µM NO3– und 40 µM PO43– enthielt. Die Kulturen wurden 21 Tage lang gezüchtet. Am 21. Tag wurde den Kulturen im Verhältnis 1:1 frisches f/2-Medium mit 880 µM NO3– und 40 µM PO43– zugesetzt. Die Kulturen wurden weitere 5 Tage lang gezüchtet.

Die Zelldichte wurde mithilfe einer Fuchs-Rosenthal-Zählkammer und einem Lichtmikroskop geschätzt. Es wurden mindestens 200 Zellen pro Probe gezählt. Die spezifische Wachstumsrate wurde als K'=\(\frac{\mathrm{ln}\left(\frac{N2}{N1}\right)}{t2-t1}\) geschätzt, wobei N1 und N2 die Zellzahlen sind zu den Zeitpunkten t1 und t2.

Von jeder Kultur wurde eine 3-ml-Probe durch einen sterilen Zelluloseacetat-Spritzenfilter mit 0,22 µm Poren filtriert. Die Phosphat- und Nitratkonzentrationen wurden spektrophotometrisch gemäß den in 60 bzw. 61 beschriebenen Protokollen bestimmt.

Der Zellzyklus photosynthetischer Dinoflagellaten, einschließlich P. cordatum, wird durch den Hell-Dunkel-Zyklus reguliert. Daher ist es für einen korrekten Vergleich der Proben wichtig, diese zu einer festen Tageszeit zu entnehmen. Die Zellproben (5–10 ml, abhängig von der Zellkonzentration) wurden alle 3 Tage zweimal täglich um 5:00 und 21:00 Uhr entnommen. Diese Zeitpunkte wurden gewählt, weil die maximale Anzahl von Zellen in der S-Phase in der Hell-Dunkel-Periode von 12:12 Uhr 4 Stunden vor dem Einschalten des Lichts beträgt, in unserem Fall 5:00 Uhr. Um 21:00 Uhr, wenn das Licht ausgeschaltet wird, sinkt die Zellteilungsrate und die Anzahl der Zellen in der S-Phase liegt nahe am Minimum22, 40. Die Kulturproben wurden durch Zentrifugation (3000 g für 3 Minuten) konzentriert und in 4 % Paraformaldehyd fixiert (PFA) bei Raumtemperatur für 40 Minuten gewaschen und in Phosphatsalzlösungspuffer (PBS) mit 100 mM Glycin für 10 Minuten gespült. Anschließend wurden die Zellen in 96 %iges Ethanol überführt und zur Pigmentextraktion mindestens 24 Stunden lang bei –20 °C gehalten. Anschließend wurden die Zellen dreimal in PBS gewaschen und mit 0,25 mg mL–1 RNase A und 0,05 mg mL–1 Propidiumiodid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proben wurden mit einem CytoFLEX-Zytometer (Beckman Coulter, Brea, CA, USA), 488-nm-Laseranregung und 585/42 BP-Emission analysiert. Für jede Probe wurden mindestens 5.000 Zellen (Kerne) erfasst. Die Zellzyklusanalyse wurde mit der ModFit LT-Software (Verity Software House, ME, USA) durchgeführt.

Um die mutmaßlichen P. cordatum-Proteine zu identifizieren, die an der Phosphataufnahme beteiligt sind, verwendeten wir nicht annotierte übersetzte Transkriptome von zwei P. cordatum-Stämmen (CCMP1329 und CCMP2233), die in der Datenbank des Marine Microbial Eukaryotic Transcriptome Sequencing Project (MMETSP; https://) verfügbar sind. www.imicrobe.us/#/projects/104, Combined Assemblies)62. Die Abfragesequenzen wurden vom National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein) bezogen und gehörten zur Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, der Hochpflanze Arabidopsis thaliana und dem Haptophyten Emiliania huxleyi. Die Zugangsnummern der Abfragen sind in Tabelle 2 aufgeführt. Die Suche nach Aminosäuresequenzen, die zu den Zielproteinen in P. cordatum-Transkriptomen homolog sind, wurde mit dem BLASTP-Algorithmus in der Software BioEdit 7.2.5 durchgeführt. Für die Analyse wurde die BLOSUM62-Bewertungsmatrix für Aminosäuresubstitutionen ausgewählt. Um die Homologie der erhaltenen Treffer erneut zu überprüfen, wurden die Sequenzen mit einem E-Wert von weniger als 10–10 als Abfragen in der umgekehrten BLASTP-Suche in der nichtredundanten NCBI-Proteinsequenzdatenbank (https://blast.ncbi.nlm.nih) verwendet .gov/Blast.cgi) und mithilfe der NCBI Conserved Domain Search-Datenbank und PROSITE (https://prosite.expasy.org) auf das Vorhandensein funktionierender Domänen überprüft. Ausgewählte Sequenzen wurden mit dem CllustalO-Algorithmus abgeglichen und mit MView visualisiert.

Die in dieser Studie analysierten übersetzten Transkriptome von zwei Stämmen von P. cordatum CCMP1329 und CCMP2233 sind in der Datenbank des Marine Microbial Eukaryotic Transcriptome Sequencing Project (MMETSP; https://www.imicrobe.us/#/projects/104, Combined Assemblies) verfügbar )62. Die Abfragesequenzen wurden aus den folgenden Datenbanken erhalten: GenBank (QHB10616.1, KAF4005909.1, QHB09608.1, KAG2518769.1, OAP03352.1, AEE74502.1, AWI47784.1, AED94948.1, AEC06729.1, AEC07951. 1), RefSeq (NP_197515.1) und UniProtKB/Swiss-Prot (Q96X52, Q8GSD9) und sind beim National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein) erhältlich.

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Die Studie wurde von der Russian Science Foundation, Projekt 22-14-00056, finanziert.

Labor für Zytologie einzelliger Organismen, Institut für Zytologie der Russischen Akademie der Wissenschaften, St. Petersburg, 1940–64, Russland

Vera Kalinina, Mariia Berdieva und Sergei Skarlato

Labor für intrazelluläre Membrandynamik, Institut für Zytologie der Russischen Akademie der Wissenschaften, St. Petersburg, 1940–64, Russland

Nikolay Aksenov

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VK, MB und SS entwarfen die Forschung, VK, MB und NA führten Experimente durch, VK und NA führten Datenanalysen durch, VK verfasste das Manuskript mit Beiträgen aller Co-Autoren.

Korrespondenz mit Vera Kalinina.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Kalinina, V., Berdieva, M., Aksenov, N. et al. Phosphormangel induziert die sexuelle Fortpflanzung beim Dinoflagellaten Prorocentrum cordatum. Sci Rep 13, 14191 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-41339-3

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Eingegangen: 16. Juni 2023

Angenommen: 24. August 2023

Veröffentlicht: 30. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-41339-3

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