Die Resistenz gegen den mutierten Isocitrat-Dehydrogenase-1-Inhibitor Ivosidenib kann durch alternative Dimere überwunden werden

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 4785 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Ivosidenib, ein Inhibitor der Varianten R132C und R132H der Isocitratdehydrogenase 1 (IDH1), ist für die Behandlung der akuten myeloischen Leukämie (AML) zugelassen. Es ist eine Resistenz gegen Ivosidenib aufgrund einer Second-Site-Mutation von IDH1 R132C entstanden, die zu IDH1 R132C/S280F führt. Wir beschreiben biochemische, kristallographische und zelluläre Studien zu den IDH1-Varianten R132C/S280F und R132H/S280F, die Aufschluss über den Mechanismus der Second-Site-Resistenz geben, der sowohl die Modulation der Inhibitorbindung an der IDH1-Dimer-Schnittstelle als auch die Veränderung der kinetischen Eigenschaften umfasst. die eine effizientere 2-HG-Produktion im Vergleich zu IDH1 R132C und IDH1 R132H ermöglichen. Wichtig ist, dass die biochemischen und zellulären Ergebnisse zeigen, dass es möglich sein sollte, die S280F-vermittelte Resistenz bei AML-Patienten durch den Einsatz alternativer Inhibitoren zu überwinden, darunter einige, die sich derzeit in klinischen Phase-2-Studien befinden.

Es ist seit langem bekannt, dass Krebszellen das Potenzial für einen veränderten Stoffwechsel haben1, aber erst seit kurzem wird dieses Wissen für therapeutische Zwecke genutzt1,2,3. Beim Menschen gibt es drei Isocitrat-Dehydrogenase-Isoformen (IDH1-3), die die Umwandlung von Isocitrat in 2-Oxoglutarat (2-OG) katalysieren; IDH1/2 nutzen NADP+ als Cofaktor, während IDH3, das Teil des Tricarbonsäurezyklus (TCA) ist, NAD+4,5 nutzt. Verschiedene somatische Mutationen in den Genen, die für die Isocitratdehydrogenase 1 (IDH1) und 2 (IDH2) kodieren, führen zu Varianten mit wesentlich erhöhter Fähigkeit, die Reduktion von 2-OG zu 2-Hydroxyglutarat (2-HG) zu katalysieren6,7,8,9. Folglich wird angenommen, dass erhöhte 2-HG-Spiegel die Tumorentstehung fördern, möglicherweise über eine Chromatindestabilisierung10. Die häufigsten IDH1-Varianten in Krebszellen sind R132H und R132C11.

Es werden mehrere IDH1- und IDH2-Inhibitoren gemeldet, obwohl nur ein IDH1-Inhibitor (Ivosidenib) und ein IDH2-Inhibitor (Enasidenib) für den klinischen Einsatz zugelassen sind, d. h. für die Behandlung von akuter myeloischer Leukämie (AML), bei der die Krebszellen eine IDH-Variante bilden12,13. Allerdings ist eine Ivosidenib-Resistenz als Folge einer Second-Site-Mutation entstanden, die IDH1 R132C/S280F produziert, wobei bisher 5 Fälle gemeldet wurden14,15,16.

Die genaue mechanistische Grundlage, auf der die Substitution an der zweiten IDH1-S280F-Stelle eine Resistenz gegen Ivosidenib ermöglicht, und ihre Folgen für die Hemmung der IDH1-Variante über die für Ivosidenib hinaus sind unklar14,15,16. Wir berichten über biochemische, strukturelle und zelluläre Studien zu IDH1 R132C/S280F und IDH1 R132H/S280F, die diese Fragen beantworten. Die Ergebnisse mit isolierten Enzymen geben Aufschluss über den Mechanismus der S280F-vermittelten Resistenz, die eine verringerte Inhibitorbindung an der Dimer-Grenzfläche und eine Veränderung der kinetischen Eigenschaften beinhaltet, was eine erhöhte 2-HG-Produktion im Vergleich zu IDH1 R132C oder R132H ermöglicht. Wichtig ist, dass die Ergebnisse zeigen, dass die S280F-Substitution eine Resistenz gegen Ivosidenib verursacht. Dies ist jedoch bei mehreren anderen IDH1-R132H- und R132C-Inhibitoren nicht der Fall, von denen sich einige in klinischen Phase-2-Studien befinden.

Um den Mechanismus der durch IDH1 S280F vermittelten Inhibitorresistenz zu untersuchen, verwendeten wir etablierte Protokolle17,18, um hochreine Formen der rekombinanten IDH1 R132C/S280F und R132H/S280F und zum Vergleich IDH1 R132C, IDH1 R132H, IDH1 Wildtyp (wt) und IDH1 herzustellen S280F (ohne IDH1 R132C oder R132H) und IDH1 R132H/Q277E (Ergänzende Abbildung 1a). Die Variante IDH1 R132H/Q277E wurde hergestellt, weil erworbene Arzneimittelresistenz gegen den mutierten IDH2-Inhibitor Enasidenib mit (i) IDH2 R140Q/I319M und (ii) IDH2 R140Q/Q316E in Verbindung gebracht wurde; IDH2 I319 ist homolog zu IDH1 S280 und IDH2 Q316 ist homolog zu IDH1 Q277 (ergänzende Abbildung 1b/c)14. In Übereinstimmung mit früheren Studien zu IDH1 R132H und R132C waren alle rekombinanten Proteine in Lösung überwiegend dimer (ergänzende Abbildung 1d – f) und wurden wahrscheinlich mit zwei NADPH-Molekülen gemeinsam gereinigt (wie für IDH1 wt und R132H18 berichtet und für IDH1 R132C, ergänzend, gezeigt). Abb. 1g/h). Während biophysikalische Studien zeigen, dass die S280F-Substitution keinen Einfluss auf die Sekundärstruktur hat (ergänzende Abbildung 1i), verbessert diese Substitution die thermodynamische Stabilität der Varianten IDH1 R132C und R132H sowie des IDH1-Gewichts erheblich (Abbildung 1b; ergänzende Abbildung 1j). ). Beachten Sie, dass im folgenden Text alle IDH-Varianten, auf die verwiesen wird, IDH1-basiert sind, sofern nicht anders angegeben.

Eine IDH1-Variante katalysierte die Oxidation von Isocitrat und die Reduktion von 2-OG zu 2-HG. b Kinetische Parameter für IDH1-Varianten (400 nM) aus nichtlinearen Regressionskurvenanpassungen (Standardfehler des Mittelwerts, n = 3). Bedingungen: 100 mM Tris, 10 mM MgCl2, 0,2 mM DTT, 0,005 % v/v Tween 20 und 0,1 mg/ml BSA (pH 8,0). Schattiert: Schmelztemperaturen (Tms) von IDH1-Varianten, gemessen durch Differentialscanningfluorimetrie (DSF, 3 µM Enzym) oder Zirkulardichroismus (CD, 0,2 mg/ml Enzym); λ: 215 nm. Bedingungen: DSF (20 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,4); CD (10 mM Natriumphosphat, pH 8,0). Weitere Informationen finden Sie in den Zusatzinformationen. c 2-HG-Bildung aus 2-OG, katalysiert durch IDH1-Varianten, gemessen durch 1H-NMR (700 MHz; Fehlerbalken: Standardfehler des Mittelwerts, n = 3 unabhängige Wiederholungen von 1H-Zeitverlaufsexperimenten). Bedingungen: 500 nM Enzym, 10 mM MgCl2, 1,5 mM 2-OG, 1,5 mM NADPH; Inkubationszeit: 12 Min. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. d 2-HG-Bildung aus Isocitrat, katalysiert durch IDH1-Varianten, gemessen durch NMR (700 MHz; Standardfehler des Mittelwerts, n = 3 unabhängige Wiederholungen von 1H-Zeitverlaufsexperimenten). Bedingungen: 750 nM Enzym, 10 mM MgCl2, 3 mM DL-Isocitrat, 1,5 mM NADP+; Inkubationszeit: 9 Min. Puffer: 50 mM Tris-d11, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 und 10 % D2O, pH 7,5. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Wir analysierten die katalytischen Aktivitäten der R132C/S280F- und R132H/S280F-Varianten und verwendeten 1H-NMR, um die Reduktion von 2-OG zu 2-HG und den zweistufigen Umsatz von Isocitrat zu 2-HG zu messen (Abb. 1a/c/ d; Ergänzende Abb. 2a/b). Aufgrund der insgesamt redoxneutralen Natur der beiden an der Umwandlung von Isocitrat in 2-HG beteiligten Reaktionen kann diese Umwandlung nicht ohne weiteres durch NADP+/NADPH-Messungen überwacht werden18. Wie erwartet zeigen die NMR-Ergebnisse, dass D-Isocitrat ein Substrat für R132C/S280F und R132H/S280F ist (ergänzende Abbildung 2c). Sie zeigen insbesondere, dass sowohl R132C/S280F als auch R132H/S280F die Umwandlung von Isocitrat zu 2-HG und von 2-OG zu 2-HG effizienter katalysieren als R132C bzw. R132H. (Abb. 1c/d)

Kinetische Analysen mit R132C/S280F und R132H/S280F zur Überwachung des NADPH-Verbrauchs mittels UV-Spektroskopie (Abb. 1b) zeigten, dass die S280F-Substitution die katalytische Effizienz (gemessen in kcat/KM) für die Umwandlung von 2-OG in 2-HG im Vergleich erhöht zu den analogen R132C- und R132H-Varianten, mit verringerten KM-Werten sowohl für 2-OG als auch für Mg2+. Im Gegensatz zu diesen Varianten war die R132H/Q277E-Variante, die überwiegend dimer ist und im Vergleich zu den anderen untersuchten IDH-Varianten eine ähnliche Sekundärstruktur aufweist (Ergänzung Abb. 1d – f, i), in 1H-NMR-Untersuchungen inaktiv (Ergänzung). Abb. 2d/e) und ist weniger stabil als R132H (Ergänzende Abb. 1j; Abb. 1b). Differentialscanning-Fluorimetrie-Studien (DSF) mit N-Oxalylglycin (NOG) als katalytisch inaktivem 2-OG-Analogon19,20 und Isocitrat (mit 10 mM Mg2+) zeigen, dass R132H/Q277E NOG oder Isocitrat zumindest nicht effizient bindet , was wahrscheinlich auf seine Inaktivität zurückzuführen ist (ergänzende Abbildung 2f).

Kinetische Analysen zur Messung des NADP+-Verbrauchs für die S280F-Variante (ohne R132C- oder R132H-Substitutionen) für die Umwandlung von Isocitrat in 2-OG (Ergänzungstabelle 1a) zeigen eine erhöhte Effizienz (kcat/KM) im Vergleich zu IDH1 wt als Ergebnis eines verringerten KM für Isocitrat; Es gab keine Änderung im scheinbaren KM für Mg2+. Bei der IDH1 S280F-Variante waren jedoch beide KM-Werte für 2-OG und Mg2+ (100-fach) für die Umwandlung von 2-OG in 2-HG verringert (Ergänzungstabelle 1b), während der kcat im Vergleich um das 10-fache verringert war zu IDH1 Gew. Die kinetischen Ergebnisse für die Umwandlungen von Isocitrat und 2-OG, gemessen durch NADP+- oder NADPH-Umsatz, stimmen weitgehend mit den 1H-NMR-Umsatztests überein (ergänzende Abbildung 3a – f). Die Ergebnisse, die zeigen, dass die S280F-Substitution die KM-Werte sowohl für Substrate als auch für Mg2+ verringert (abgesehen von der durch IDH1 S280F katalysierten Umwandlung von Isocitrat in 2-OG), sind bemerkenswert, da neuere Arbeiten gezeigt haben, dass die allosterische Dimer-Schnittstellenbindung von Inhibitoren der IDH1-Variante erfolgt behindert sowohl die Mg2+- als auch die Substratbindung18.

Um die mechanistischen Konsequenzen der S280F-Substitution weiter zu untersuchen, haben wir die IDH1-Varianten mithilfe der Cyclovoltammetrie untersucht (ergänzende Abbildung 3g – l), mit der Geschwindigkeiten in jeder NADP (H) -Zyklusrichtung gemessen und die Umwandlung von Isocitrat in 2 unterschieden werden können -OG aus der Reduktion von 2-OG zu 2-HG17. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass R132C und R132C/S280F die Umwandlung von Isocitrat in 2-OG mit ähnlicher Effizienz katalysieren (ergänzende Abbildung 3 g/h). Allerdings ist die Effizienz der Gesamtumwandlung von Isocitrat in 2-HG für R132C/S280F im Vergleich zu R132C (Abb. 1d) erhöht, wobei die Umwandlungsrate von 2-OG zu 2-HG im Vergleich zu IDH1 R132C (Supplementary) ungefähr verdoppelt ist Abb. 3g/h). Die Ergebnisse der Cyclovoltammetrie zeigen, dass R132H/S280F im Vergleich zu R132H eine höhere Effizienz aufweist (ungefähr doppelt so hoch), sowohl bei der Umwandlung von Isocitrat in 2-OG als auch von 2-OG in 2-HG (ergänzende Abbildung 3i/j). IDH1 S280F (ohne R132C oder R132H) zeigt im Vergleich zu IDH1 wt eine zweifach erhöhte Reaktionsgeschwindigkeit für die Umwandlung von Isocitrat in 2-OG (ergänzende Abbildung 3k/l).

Obwohl die drei Umsatztests zur Messung der NADPH-Absorption, der 1H-NMR-Resonanzen oder der Cyclovoltammetrie-Parameter unterschiedliche Bedingungen verwendeten, zeigen sie alle, dass die S280F-Substitution die Effizienz der R132C- und R132H-Varianten bei der Umwandlung von Isocitrat in 2-HG verbessert, hauptsächlich durch Steigerung die Reduktionsrate von 2-OG zu 2-HG.

Frühere Studien haben gezeigt, dass die meisten Inhibitoren der IDH-Variante, wahrscheinlich auch Ivosidenib (es gibt keine berichtete Kristallstruktur für Ivosidenib im Komplex mit einer IDH1-Variante), an der IDH1/IDH2-Dimerschnittstelle21,22,23,24,25,26 binden. Wir haben kürzlich gezeigt, dass die durch Inhibitoren vermittelte Störung der Mg2+-Bindung auf eine Weise erfolgt, die die Umwandlung von 2-OG zu 2-HG im Vergleich zur Wildtyp-Reaktion von Isocitrat zu 2-OG18 überproportional beeinflusst. In Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen unter Verwendung von NOG und Isocitrat deuten DSF-Analysen darauf hin, dass Mg2+ für die effiziente Bindung von Isocitrat und 2-OG an R132C, R132C/S280F, R132H und R132H/S280F erforderlich ist (ergänzende Abbildung 3m/n). Es ist möglich, dass die S280F-Substitution die Affinität der Mg2+-Bindung erhöht, zumindest für die durch R132C/R132H katalysierte Umwandlung von 2-OG zu 2-HG.

Anschließend untersuchten wir die Hemmung von isoliertem R132C, R132C/S280F, R132H, R132H/S280F durch Ivosidenib (Abb. 2a; ergänzende Abb. 4a). NMR- und MS-Analysen zeigen beide, dass die S280F-Substitution die Bindungseffizienz von Ivosidenib verringert (Abb. 2b) und dass die Stöchiometrie der Ivosidenib-Bindung ein Inhibitormolekül pro Dimer beträgt (Abb. 2c); Diese Beobachtungen stehen im Einklang mit früheren Arbeiten zur Hemmung von IDH1 wt und R132H durch Ivosidenib18. Basierend auf Modellstudien15,16 wurde vorgeschlagen, dass die Resistenz gegen Ivosidenib durch eine Behinderung der Inhibitorbindung aufgrund der Substitution von S280 durch ein sterisch anspruchsvolleres Phenylalanin (S280F) vermittelt wird und dass die Ivosidenib-Bindung zusätzlich durch den Verlust von a behindert wird Wasserstoffbrücke zur Alkoholseitenkette von S28016. Um zu untersuchen, ob der Widerstand ausschließlich durch sterische Hinderung vermittelt wird oder andere Faktoren eine Rolle spielen, einschließlich solcher, die mit einem möglichen Verlust einer Wasserstoffbindung zu S280 zusammenhängen, haben wir R132C/S280A hergestellt. Ivosidenib hemmt R132C/S280F oder R132H/S280F nicht (zumindest nicht effizient) (Abb. 2a), hemmt jedoch R132C/S280A mit einem IC50 von 992 nM im Vergleich zu IC50 von 2,5 nM für R132C (ergänzende Abb. 4b). Diese Beobachtung legt nahe, dass sowohl die sterische Hinderung durch die Phenylalanin-Seitenkette als auch der Verlust einer Wasserstoffbindung zu S280 zur Ivosidenib-Resistenz beitragen können (R132C/S280A wird weniger stark gehemmt als R132C, während R132C/S280F nicht gehemmt wird) (Abb. 2a). ; Ergänzende Abb. 4b). Dieser Vorschlag steht im Einklang mit Inhibitorbindungsstudien unter Verwendung von nicht denaturierendem MS und CPMG-NMR (Abb. 2b), die eine Abnahme der Affinität von R132C/S280A für Ivosidenib im Vergleich zu R132C zeigen, die Abnahme ist jedoch für R132C/S280F deutlicher (Abb. 2b).

a Hemmung (%) von IDH1-Varianten (400 nM) durch Ivosidenib (10 µM), bestimmt durch den NADPH-Absorptionstest. Fehler: Standardfehler des Mittelwerts (n = 3 unabhängige Replikate, gemessen auf derselben 96-Well-Platte). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. b KDs bestimmt durch nicht denaturierende MS (20 µM Enzym, technische Fehler: n = 3 für die z = 19, 20, 21 Ladungszustände) und unter Verwendung der Puls-NMR-Sequenz des CPMG-Projekts (10 µM Enzym, n = 2). Nicht denaturierendes MS: Ammoniumcitratpuffer (200 mM, pH 7,5); CPMG-NMR: 50 mM Tris-d11, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 und 10 % D2O, pH 7,5. c Nicht denaturierende MS-Analyse zur Messung der Bindung von Ivosidenib an IDH1-Varianten. Bei 20 µM sind IDH1-Varianten überwiegend dimer mit 2 gebundenen NADP(H)-Molekülen – gestrichelte Linie. Der grüne Hintergrund entspricht der Bindung eines Ivosidenib-Moleküls. Endkonzentrationen von Ivosidenib: 5 µM (4:1), 20 µM (1:1) und 160 µM (1:8). Kegelspannung: 100 V.

Die kombinierten Ergebnisse zeigen, dass die S280F-Substitution sowohl die Bindung von Ivosidenib schwächt als auch die Umwandlung von 2-OG in 2-HG fördert. Bemerkenswerterweise fördert die S280F-Substitution an der zweiten Stelle zumindest im Vergleich zu den einzelnen R132C- oder R132H-Substitutionen auch die Umwandlung von Isocitrat in 2-HG in Abwesenheit eines Inhibitors (Abb. 1d). Interessanterweise hat IDH1 S280F (ohne R132C oder R132H) im Vergleich zu IDH1 wt eine erhöhte katalytische Effizienz für den Umsatz von Isocitrat zu 2-OG, jedoch nicht für die Reduktion von 2-OG zu 2-HG (Ergänzungstabelle 1a/b; Ergänzende Abb. 3k/l), was auf eine mögliche Kooperation zwischen den beiden Substitutionsstellen im Hinblick auf die Steigerung der Wirksamkeit der Gesamtumwandlung von Isocitrat in 2-HG schließen lässt. Sowohl für Isocitrat als auch für 2-OG ist die Substratbindung (gemäß KM) in IDH1 S280F erhöht (Ergänzungstabelle 1a/b). Bei der Reduktion von 2-OG zu 2-HG wird der KM von Mg2+ für IDH1 S280F im Vergleich zum IDH1-Gewicht um das Hundertfache verringert, wohingegen er sich bei der Umwandlung von Isocitrat zu 2-OG nicht ändert. Diese kombinierten Beobachtungen deuten darauf hin, dass die S280F-Substitution die Substratbindung (Isocitrat oder 2-OG) fördert, die Auswirkungen auf die Mg2+-Bindung jedoch von der katalysierten Reaktion abhängen, d. h. Isocitrat zu 2-OG oder 2-OG zu 2-HG. Diese Schlussfolgerung steht im Einklang mit neueren Arbeiten, die zeigen, dass die Bindung von Substraten und Mg2+ an IDH1-Varianten Konformationsänderungen beinhaltet, einschließlich Bewegungen der α-Helices (α9 und α10), die an der Bildung der Dimer-Schnittstelle beteiligt sind18; Beachten Sie, dass es Hinweise darauf gibt, dass IDH1 eine Reaktivität an der halben Stelle aufweist27. Bemerkenswert ist, dass Ivosidenib und zumindest einige andere Inhibitoren der IDH-Variante auch an IDH1 wt (und wahrscheinlich an IDH2 wt) binden können, diese jedoch nicht effizient hemmen18. Diese Beobachtungen veranschaulichen die Komplexität der Konformationsdynamik an der IDH1-Dimer-Schnittstelle und wie sie mit der Chemie des aktiven Zentrums verknüpft ist. Diese subtilen mechanistischen Probleme, einschließlich der möglichen Modulation von Mg2+ und der Substratbindung, machen es schwierig, genau vorherzusagen, wie sich die allosterische Ligandenbindung an der Dimer-Schnittstellenstelle in Bezug auf die Hemmung manifestieren wird. Wir haben daher einen Satz von 14 gemeldeten Inhibitoren der IDH-Variante gegen R132C/S280F und R132H/S280F mit isolierten Enzymen gescreent (ergänzende Abbildung 4a/c).

Wichtig ist, dass sieben der Inhibitoren zwar keine Hemmung von R132C/S280F oder R132H/S280F zeigten (darunter einer, SYC-435, von dem berichtet wurde, dass er an das aktive Zentrum bindet 28 ), die Screening-Ergebnisse (ergänzende Abbildung 4c) zeigten, dass sieben der Inhibitoren keine Hemmung zeigten Inhibitoren behielten ihre Aktivität gegen die Doppelvarianten, d. h. GSK321, GSK864, IDH224, IDH305, IDH556, FT-2102 und DS-1001B. Einige dieser Inhibitoren weisen eine hohe Wirksamkeit auf (IC50s < 100 nM), z. B. IDH224, FT-2102 (nur gegen R132H/S280F) und DS-1001B (Abb. 3a). Für weitere Studien wurden starke repräsentative Inhibitoren aus jeder Inhibitorserie ausgewählt (z. B. GSK864, IDH224, FT-2102, DS-1001B). Bemerkenswerterweise zeigten nicht denaturierende MS-Studien, dass alle diese Inhibitoren mit einer Stöchiometrie von 2 Molekülen an jedes IDH1-Dimer binden können (Abb. 3b; ergänzende Abb. 4d). Beachten Sie, dass diese Beobachtung im Gegensatz zu der für Ivosidenib steht, wo nur ein Inhibitormolekül beobachtet wurde, das an das IDH1-Dimer bindet (Abb. 2c). Die Inhibitorbindungsaffinität (bestimmt durch nicht denaturierende MS) war im Allgemeinen für R132C/S280F und R132H/S280F niedriger als für R132C bzw. R132H, obwohl sie für FT-2102 nicht verändert ist (Abb. 3c). Der stärkste R132C/S280F-Inhibitor, DS-1001B, wurde ebenfalls in einem Lösungstest (unter Verwendung von CPMG-NMR) analysiert und zeigte eine starke Bindung an alle getesteten Varianten, mit der niedrigsten Affinität für R132H/S280F (KD = 4,19 µM). ) im Vergleich zu den anderen getesteten IDH1-Varianten (Abb. 3c).

a IC50-Werte (Standardfehler des Mittelwerts, n = 3) mit IDH1-Varianten (bei 30 nM); ni = keine Hemmung beobachtet. Bedingungen: 100 mM Tris, 10 mM MgCl2, 0,2 mM DTT, 0,005 % v/v Tween 20 und 0,1 mg/ml BSA (pH 8,0). b Nicht denaturierende MS-Analysen. Gestrichelte Linie: IDH1-Dimer (z = 20, mit 2 gebundenen NADP(H)-Molekülen), grüne Schattierung entspricht der Bindung eines Inhibitormoleküls, mintfarbene Schattierung entspricht der Bindung von 2 Inhibitormolekülen. Bedingungen: 20 µM IDH1-Variante, 20 µM Inhibitor, Kegelspannung: 100 V. c KD-Bestimmungen (Standardfehler des Mittelwerts), gemessen mit nicht denaturierendem MS (20 µM Enzym, technische Fehler: n = 3 für z = 19, 20, 21 Ladungszustände) und CPMG-NMR (Werte in Klammern, 10 µM Enzym, n = 2). Nicht denaturierendes MS: Ammoniumcitratpuffer (200 mM, pH 7,5); CPMG-NMR: 50 mM Tris-d11, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 und 10 % D2O, pH 7,5.

Umsatztests unter Verwendung des NADPH-Absorptionstests deuten darauf hin, dass die Hemmung durch R132C, R132C/S280F, R132H und R132H/S280F offenbar mit den Mg2+- und 2-OG-Spiegeln konkurriert; Die Wirksamkeit des Inhibitors wurde durch Schwankungen der NADPH-Konzentrationen nicht wesentlich beeinflusst, außer möglicherweise bei FT-2102 (ergänzende Abbildung 5a – c).

Um die Auswirkungen der S280F-Substitution auf die Inhibitorbindung weiter zu untersuchen, arbeiteten wir an der Erfassung kristallographischer Informationen und erhielten eine Struktur von R132C/S280F im Komplex mit Calcium, 2-OG und NADPH (2,1 Å Auflösung, Raumgruppe: C2221, drei Moleküle (A –C) in der asymmetrischen Einheit (ergänzende Abbildung 6a), PDB: 7PJM; die Struktur wurde unter Verwendung einer gemeldeten Struktur von R132H als Suchmodell gelöst19; Abb. 4a – d).

eine Bandansicht einer Kristallstruktur von R132C/S280F (PDB: 7PJM, 2,1 Å Auflösung). Wie in der asymmetrischen Einheit beobachtet, wird scheinbar ein Dimer aus Kette A (Weizen) und Kette B (grün) gebildet. Orangefarbene Kreise: aktive Zentren mit 2-OG, NADPH und Kalzium. L1-Schleife: violett. b Nahaufnahme mit einer Polder-Auslassungskarte (blaues Netz, Kontur 3,0 σ), die 2-OG, NADPH und Kalzium zeigt. Die L1-Schleife, die die Dimer-Schnittstelle bedeckt, ist violett. Schwarzer Kreis: Dimer-Schnittstelle mit einer Polder-Omit-Karte (blaues Netz, Kontur: 3,0 σ) mit F280 (Cyan). c Ansicht der Dimer-Grenzfläche, die hydrophobe Wechselwirkungen zwischen W124 (L1), F280 (Cyan, α10) und W267 in beiden Monomeren hervorhebt. d Blick auf die Metallbindungsstelle. Dargestellt sind die kalziumbindenden Reste D252 (Monomer 1, Weizen, α9), D275 und D279 (Monomer 2, grün, α10). e Bandansicht einer Kristallstruktur von R132C/S280F (PDB: 7PJN, 2,45 Å Auflösung), komplexiert mit 2 NADPH- und 2 DS-1001B-Molekülen (orange); Das Enzym liegt wahrscheinlich in einer offenen inaktiven Konformation vor. Ein scheinbares Dimer wird aus Kette B (Weizen) und Kette C (grün) gebildet, wie in der asymmetrischen Einheit beobachtet. DS-1001B bindet an der Dimer-Schnittstelle (schwarzer Kreis). f Polder lässt die Karte (blaues Netz, Kontur: 3,0 σ) weg, die DS-1001B und den Rest F280 (Cyan) in der Dimer-Grenzfläche zeigt. Beachten Sie, dass die L1-Schleife (violett) die Dimer-Schnittstelle abdeckt.

Ein Vergleich mit berichteten IDH1-Strukturen19,29 legt nahe, dass die R132C/S280F-Struktur wahrscheinlich eine geschlossene Konformation des aktiven Zentrums widerspiegelt (die Breiten der beiden Spalten des aktiven Zentrums im scheinbaren Homodimer, das durch die Ketten A und B gebildet wird, gemessen anhand der Abstände zwischen I76 und L250). sind Reste am Eingang des aktiven Zentrums29, sind 12,6 Å und 13,0 Å groß, was auf eine geschlossene Konformation 29 hinweist; ergänzende Abbildung 6b/c). Die Struktur zeigt, dass die Phenylringe der beiden S280F-Reste, die sich auf α10 befinden, an der Dimer-Grenzfläche nebeneinander liegen (Abb. 4a/b); Zusammen mit den Seitenketten von W124 und W267 erzeugt die Phenylgruppe von S280F einen erhöhten hydrophoben Bereich an der Dimer-Grenzfläche (Abb. 4c), was möglicherweise die erhöhte thermische Stabilität der S280F-Varianten widerspiegelt (Abb. 1b; ergänzende Abb. 1j). .

In der R132C/S280F-Struktur fällt auf, dass die L1-Schleife, die teilweise die Inhibitorbindungstasche bedeckt (Abb. 4b; ergänzende Abb. 7a/b), eine andere Konformation annimmt als die, die in einer mit komplexierten R132H-Kristallstruktur beobachtet wird Kalzium, 2-OG und NADPH19. Obwohl der Unterschied in der L1-Schleifenkonformation (teilweise) auf unterschiedliche Kristallisationsbedingungen zurückzuführen sein könnte, unterstreicht diese Beobachtung die Bedeutung von Konformationsbewegungen während der IDH1-Katalyse und -Hemmung. Darüber hinaus gibt es Unterschiede in der Konformation des metallbindenden Rests Asp-252 (Abb. 4d; ergänzende Abb. 7c/d) in der R132C/S280F-Struktur im Vergleich zu denen, die in anderen Strukturen, einschließlich R132H19, beobachtet wurden. Die allgemeine Natur der 2-OG-Bindung, einschließlich der Chelatbildung durch das Calciumion, bleibt jedoch in den verschiedenen Strukturen unverändert (ergänzende Abbildung 7d).

Wir haben eine Kristallstruktur von R132C/S280F im Komplex mit NADPH und seinem wirksamen Inhibitor DS-1001B erhalten (Auflösung 2,45 Å, Raumgruppe: P21212, vier Moleküle (A – D) in der asymmetrischen Einheit (Ergänzende Abbildung 8a), PDB: 7PJN ; die Struktur wurde unter Verwendung einer berichteten inhibitorgebundenen Struktur von R132H als Suchmodell gelöst31; Abb. 4e/f). In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der nicht denaturierenden MS (Abb. 3b) zeigt die Struktur zwei DS-1001B-Moleküle, die an der Dimer-Grenzfläche gebunden sind (Abb. 4e). Interessanterweise binden die beiden DS-1001B-Moleküle so, dass ihre Trichlorphenylringe benachbart sind, eine Beobachtung, die im Hinblick auf zukünftige Bemühungen der medizinischen Chemie zur Verbesserung der Inhibitorbindung von Interesse ist (Abb. 4f). Die Struktur des DS-1001B-Komplexes spiegelt wahrscheinlich eine offene oder halboffene (inaktive) Konformation wider: Die Breite der beiden Spalten im aktiven Zentrum im scheinbaren Homodimer, das durch Kette B und Kette C gebildet wird, gemessen an den Abständen zwischen I76 und L250, beträgt 17,7 Å (halboffen) und 20,2 Å (offen; ergänzende Abbildung 8b/c). Wie bereits für die inaktive Konformation 23 berichtet, ist α10 in beiden Monomeren teilweise ungeordnet und nimmt eine teilweise Schleifenkonformation an (ergänzende Abbildung 9), die möglicherweise zur Anpassung an die Inhibitorbindung beiträgt. Bemerkenswert ist, dass im Gegensatz zur Struktur von R132C/S280F ohne Inhibitor in der DS-1001B-Komplexstruktur die S280F-Reste der beiden Monomere nicht benachbart, sondern 14,9 Å voneinander entfernt sind (nächstliegendes C-Atom, ergänzende Abbildung 10).

Obwohl im Einklang mit den Lösungsstudien darauf geachtet werden sollte, die Unterschiede in den unter verschiedenen Bedingungen erhaltenen Kristallstrukturen nicht zu überinterpretieren, zeigen unsere kristallographischen Ergebnisse, dass die S280F-Substitution sowohl die Chemie an der Dimer-Grenzfläche beeinflusst, an der Ivosidenib wahrscheinlich bindet, als auch Potenzial hat Einfluss auf die Chemie des aktiven Zentrums haben, auch im Hinblick auf die Bindung von Metallionen und infolgedessen auch auf die Bindung des Substrats. In Kombination mit anderen Strukturen und neueren kinetischen und anderen biophysikalischen Studien18,27 unterstreichen diese biophysikalischen Ergebnisse die Rolle der Konformationsdynamik und -komplexität bei der IDH-(Varianten-)Katalyse. Die genaue Beschaffenheit dieser Faktoren und ihre Hemmeffekte zu definieren, ist eine Herausforderung und erfordert Strukturstudien zu individuellen Umsätzen in Verbindung mit Modellierungen. Daher schlagen wir vor, dass die Hemmung der IDH-Variante, auch im Hinblick auf die Bekämpfung von Resistenzen, grundsätzlich durch einen empirisch geleiteten Ansatz verfolgt werden sollte, der verschiedene Arten von Umsatz- und Bindungstests in Verbindung mit zellulären Studien in einem frühen Stadium einsetzt.

Unterstützt wird dieser Ansatz durch die Ergebnisse zellulärer Studien an fünf ausgewählten (potenziellen) R132C/S280F-Inhibitoren, nämlich Ivosidenib, GSK864, IDH224, FT-2102 und DS-1001B (Abb. 5). Eine LN-18-Glioblastomzelllinie (ATTC CRL-2610) wurde zur Herstellung rekombinanter IDH1-Varianten (R132C, R132C/S280F, R132H, R132H/S280F) verwendet, wie in der ergänzenden Abbildung 11 dargestellt.

LN18-Zellen wurden mit den Inhibitoren Ivosidenib, GSK864, FT-2102, IDH224 und DS-1001B in DMSO (Endkonzentration: 5 µM) behandelt. Die 2-HG-Spiegel wurden durch an MS51 gekoppelte Anionenaustauschchromatographie bestimmt (Fehler: Standardfehler des Mittelwerts, n = 4 unabhängige Replikate). Beachten Sie, dass Ivosidenib bei der Senkung der 2-HG-Spiegel in R132C/S280F- und R132H/S280F-tragenden Zellen zwar nicht oder nur unzureichend aktiv ist, die anderen Inhibitoren jedoch bei der Senkung der 2-HG-Spiegel aktiv sind. Kontrollzellen wurden durch Transduktion mit lentiviralen Vektoren erzeugt, die kein IDH1 enthielten. Box-and-Whisker-Diagramme: Die Mittellinie ist der Median und die Grenzen sind die Werte des 25. und 75. Perzentils. Die Whiskers sind die minimal und maximal gemessenen 2-HG-Werte für jede Versuchsgruppe. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Wie erwartet hatten die Inhibitoren bei Kontrollzellen, die keine IDH1-Varianten exprimieren, innerhalb eines Fehlers keine erkennbare Wirkung auf die geringen Mengen des vorhandenen endogenen 2-HG (Abb. 5). In Übereinstimmung mit den berichteten Ergebnissen24,26,32 unterdrückten alle Inhibitoren wirksam die Produktion von 2-HG in Zellen, die R132C und R132H überproduzierten. Im Gegensatz dazu waren die Wirkungen der fünf Inhibitoren auf Zellen, die R132C/S280F oder R132H/S280F überproduzierten, unterschiedlich. In Übereinstimmung mit den biochemischen Daten, die zeigen, dass die S280F-Substitution eine Resistenz gegen Ivosidenib verursacht, und früheren klinischen Ergebnissen14,15,16 war Ivosidenib bei der Unterdrückung der 2-HG-Produktion in den R132C/S280F- und R132H/S280F-überproduzierenden Zellen unwirksam (Abb. 5). In den R132C/S280F-überproduzierenden Zellen war GSK864 bei der Senkung der 2-HG-Spiegel nur mäßig wirksam, wohingegen IDH224, DS-1001B und FT-2102 bei der Senkung der 2-HG-Spiegel wirksamer waren. Interessanterweise war FT-2102 relativ weniger wirksam als IDH224 und DS-1001B gegen isoliertes R132C/S280F (Abb. 3a; IC50 1,3 µM). Die relativ hohe Wirksamkeit von FT-2102 in Zellen spiegelt möglicherweise eine verbesserte Zellpermeabilität im Vergleich zu IDH224 und DS-1001B wider.

Im Fall von R132H/S280F (Abb. 5) waren die Ergebnisse für die Behandlung mit Ivosidenib, GSK864, IDH224 und FT-2102 analog zu denen für R132C/S280F-tragende Zellen. Bemerkenswerterweise war DS-1001B in diesem zellulären Kontext jedoch ein relativ schlechter Inhibitor von R132H/S280F. Dieser Unterschied spiegelt wahrscheinlich zumindest teilweise den höheren IC50-Wert für DS-1001B im Vergleich zu isoliertem R132H/S280F im Vergleich zu den Werten für die anderen getesteten IDH1-Varianten wider (Abb. 3a).

Obwohl es, wie oben beschrieben, Unterschiede in der relativen Effizienz der Inhibitoren gibt, korrelieren die zellulären Ergebnisse gut mit den Ergebnissen für isolierte IDH1-Varianten. Am wichtigsten ist, dass sie zeigen, dass spezifische Inhibitoren, darunter FT-2102 und DS-1001B, die sich in klinischen Phase-2-Studien befinden33,34,35, die 2-HG-Spiegel in R132C/S280F-tragenden Zellen wirksam senken.

Die Entwicklung von Inhibitoren der IDH-Variante stellt einen Durchbruch in der Krebsbehandlung dar, da sie ein bahnbrechendes Beispiel dafür ist, wie der Stoffwechsel durch niedermolekulare Medikamente erfolgreich angesteuert werden kann. Wie erwartet ist jedoch eine Resistenz gegen das Pioniermedikament Ivosidenib entstanden, insbesondere durch die S280F-Substitution an der Dimer-Schnittstelle14,15,16. Ergebnisse des Inhibitor-Screenings mit isolierten IDH1-Varianten zeigen, dass weder die Varianten R132C/S280F noch R132H/S280F durch Ivosidenib (effizient) gehemmt werden. Wichtig ist jedoch, dass dieses Ergebnis auch für einige, aber nicht alle der gemeldeten Inhibitoren der IDH-Variante gilt, die sich derzeit in der Entwicklung befinden. Somit sollte es möglich sein, die durch Dimer-Schnittstellenmutanten verursachte Resistenz gegen IDH-Inhibitorvarianten durch geeignete medizinische Chemieprogramme zu überwinden.

Die kombinierten biochemischen und strukturellen Ergebnisse zeigen, dass die S280F-Substitution eine Resistenz gegen Ivosidenib in Krebszellen ermöglicht, die R132C/S280F oder R132H/S280F produzieren, teilweise durch Behinderung der Bindung an die IDH1-Dimerschnittstelle und teilweise durch Erhöhung der Effizienz der R132C- und R132H-Varianten bei der Katalyse der Umwandlung von Isocitrat und/oder 2-OG zu 2-HG. Die hier und anderswo berichteten Studien18 deuten darauf hin, dass die allosterische Bindung von Inhibitoren der IDH-Variante an der Dimer-Grenzfläche die Bindung von Mg2+ im aktiven Zentrum (oder Mg2+-Substratkomplex im Fall von Isocitrat) in einer Weise beeinflusst, die die Umwandlung von 2-OG in 2-HG überproportional hemmt im Vergleich zur Umwandlung von Isocitrat in 2-OG. Die genauen molekularen Gründe für diese Beobachtungen sowie die Einzelheiten der IDH1-Wt-Katalyse sollten Gegenstand zukünftiger zeitaufgelöster biophysikalischer Studien sein.

Obwohl die in vivo-Krebsrelevanz der beobachteten erhöhten katalytischen Effizienz von R132C S280F in vitro unbekannt ist, kann sie dazu beitragen, erhöhte 2-HG-Spiegel in Gegenwart eines Inhibitors der IDH-Variante aufrechtzuerhalten. Wenn dies der Fall ist, unterstützt dies die funktionelle Rolle von 2-HG in reifen Krebszellen und führt folglich zu einer Behandlung auf Inhibitorbasis, die zu einer Verringerung der 2-HG-Spiegel führt. Beachten Sie, dass die Rolle von 2-HG in reifen Krebszellen eine andere sein kann oder zusätzlich zu der vorgeschlagenen Rolle erhöhter 2-HG-Spiegel bei der Tumorentstehung36,37.

Trotz der mechanistischen Komplexität der Hemmung der IDH1-Variante durch allosterische Bindung zeigen unsere Ergebnisse deutlich, dass die R132C/S280F-vermittelte Resistenz gegen Ivosidenib durch den Einsatz anderer Inhibitoren, z. B. IDH224, FT-2102, DS-1001B und wahrscheinlich verbesserter Varianten davon, überwunden werden kann . Wie Ivosidenib binden auch diese Inhibitoren an der Dimer-Grenzfläche; Im Gegensatz zu Ivosidenib, das mit einer Stöchiometrie von einem Inhibitormolekül pro Dimer der IDH1-Variante bindet, binden die wirksamen R132C/S280F-Inhibitoren (wie durch biochemische und zelluläre Studien gezeigt) mit einer Stöchiometrie von zwei Inhibitormolekülen pro Dimer, wie durch Nichtdenaturierung gezeigt wird MS-Studien und kristallographische Analysen von R132C/S280F mit und ohne Inhibitor. Wichtig ist, dass sich zwei Inhibitoren von R132C/S280F und R132H/S280F, FT-2102 und DS-1001B, bereits in klinischen Phase-2-Studien befinden33,34,35. Es besteht daher die Möglichkeit, effiziente Behandlungsschemata zu entwickeln, bei denen bei Auftreten von Resistenzen ein Inhibitor der IDH-Variante durch einen anderen ersetzt wird. Es besteht auch die Möglichkeit, Kombinationen von Inhibitoren zu verwenden, insbesondere wenn die voraussichtlich auftretenden Resistenzarten vor der Erstbehandlung vorhergesagt werden können.

Aktuelle Studien zu den Mechanismen von IDH1 und seinen Varianten sowie zur Wirkungsweise der gemeldeten Inhibitoren der IDH-Variante18 haben zu der Vermutung geführt, dass allosterische Inhibitoren teilweise aufgrund der verwendeten Screening-Bedingungen bevorzugt identifiziert wurden, d. h. die Screens wurden nicht mit diesen durchgeführt unterschiedliche Mg2+-Konzentrationen. Die Natur von S280F, die eine Ivosidenib-Resistenz gegen R132C/S280F ermöglicht, legt nahe, dass die Entwicklung neuer Arten von IDH-Inhibitoren, einschließlich solcher, die nicht durch allosterische Bindung an die Dimer-Schnittstelle wirken, von Interesse ist. Es ist möglich, dass die Bindung von Inhibitoren an der IDH-Dimer-Schnittstelle, die an subtilen Konformationsänderungen während der Katalyse beteiligt ist, im Vergleich zu solchen, die an der aktiven Stelle binden und/oder mit NADPH konkurrieren, besonders anfällig für Resistenzen ist. Es sollte jedoch beachtet werden, dass die S280F-Substitution eine Resistenz gegen einen Inhibitor, SYC-435, verleiht, der Berichten zufolge an das aktive Zentrum von IDH1 bindet28.

Aufgrund der begrenzten verfügbaren klinischen Daten zum jetzigen Zeitpunkt ist es schwierig vorherzusagen, wie sich eine Resistenz gegen Inhibitoren der IDH-Variante entwickeln wird. Wir schlagen daher vor, dass neben der Optimierung der derzeit wirksamen Inhibitoren, die an der Dimer-Grenzfläche binden, auch die Entwicklung von Inhibitoren der IDH-Variante sinnvoll ist, die über Mechanismen wirken, die keine allosterische Bindung beinhalten. Unsere Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass zukünftige Bemühungen in der medizinischen Chemie optimalerweise mehrere IDH1/2-Varianten einsetzen sollten, einschließlich Resistenz-ermöglichender Mutationen in isolierter Form (unter verschiedenen Testbedingungen) sowie empirisch gesteuerter Zell- und In-vivo-Analysen.

Vorwärts- und Rückwärtsprimer zur Einführung unterschiedlicher Mutationen wurden gemäß den beschriebenen Verfahren entworfen38. Als Matrize wurde ein pET22b-Plasmid (Sigma-Aldrich) verwendet. IDH1 R132H/S280F und R132C wurden aus einer IDH1 R132H-DNA-Matrize hergestellt (erhalten wie beschrieben18). IDH1 R132C/S280F und R132C/S280A wurden aus einer R132C-DNA-Matrize hergestellt. IDH1 S280F wurde aus einer IDH1-Wt-DNA-Matrize hergestellt. Die Reaktionen wurden (2-Stufen-Methode) unter Verwendung der Q5® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs), eines Desoxynukleotidlösungsgemischs (New England Biolabs) und eines GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) durchgeführt. Die Mischung wurde mit dem GeneJET PCR Purification Kit (Thermo Scientific) gemäß dem Protokoll des Herstellers gereinigt. Die Matrizen-DNA wurde mit Dpn1 (New England Biolabs; 3 h Inkubation, 37 °C) verdaut. Das Produkt wurde in XL10-Goldzellen (Agilent) transformiert. Kolonien wurden über Nacht in 10 ml 2TY-Medium gezüchtet und das Plasmid mit dem GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific) extrahiert. Die Plasmide wurden mit MilliQ-gereinigtem Wasser eluiert. Die Sequenzen wurden durch Sanger-Sequenzierung bestätigt, die von Eurofins Scientific durchgeführt wurde.

Die rekombinante Proteinproduktion wurde wie beschrieben durchgeführt17,18. Kurz gesagt, die rekombinanten Proteine wurden in BL21(DE3)plysS E.coli-Zellen mit 1 mM Isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG) bei einer Post-Induktionstemperatur von 20 °C produziert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und durch Ultraschallbehandlung lysiert. Die Zelllysate wurden auf eine 5 ml HisTrap HP-Säule (Cytiva) geladen und mit einem Imidazol-Stufengradienten (bis zu 500 mM) eluiert. Fraktionen, die das gewünschte Protein enthielten, wurden unter Verwendung einer Superdex S200-Säule (GE Healthcare, 300 ml) durch isokratische Elution weiter gereinigt. Die Reinheit der Fraktionen wurde mittels SDS-PAGE-Gelelektrophorese bewertet (ergänzende Abbildung 1a). Die Proteinkonzentrationen wurden mit einem Nanodrop One-Gerät (Thermo Scientific) bestimmt und entsprechen der IDH1-Monomerkonzentration.

Für kristallographische Untersuchungen wurde IDH1 R132C/S280F zusätzlich durch Anionenaustauschchromatographie gereinigt. Nach der anfänglichen Reinigung mit einer 5-ml-HisTrap-HP-Säule (Cytiva) wurden die Fraktionen, die das gewünschte Protein enthielten, einem Pufferaustausch mit einer PD-10-Säule (Merck) unterzogen und auf eine Cytiva Q Sepharose Fast Flow-Säule geladen. Das Protein wurde mit einem NaCl-Gradienten (bis zu 1 M) eluiert und anschließend einer Gelfiltrationsreinigung (Superdex S200-Säule (GE Healthcare, 300 ml)) mit isokratischer Elution unter Verwendung von Puffer mit 20 mM Tris und 100 mM NaCl (pH 7,4) unterzogen.

Für elektrochemische Experimente wurde Ferredoxin-NADP+-Reduktase (FNR) aus Chlamydomonas reinhardtii wie beschrieben hergestellt39. Kurz gesagt, rekombinantes FNR wurde in BL21(DE3)plysS E. coli-Zellen durch Zugabe von 1 mM IPTG produziert und die Kulturen wurden weitere 4 Stunden lang (37 °C) gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet; Die Pellets wurden in einem kleinen Volumen Kältepuffer (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM DTT; pH 7,4) resuspendiert und über Nacht bei –80 °C gelagert. Die Zellen wurden aufgetaut und unter Verwendung einer French Press bei 20 psi lysiert, und das Lysat wurde bei 4 °C unter Verwendung einer Ultrazentrifuge (Beckman L8-70M Ultracentrifuge) zentrifugiert. FNR wurde aus dem Überstand mithilfe einer Ni2+ HisTrap HP-Affinitätssäule (GE Healthcare Life Sciences) isoliert und mithilfe eines Imidazolgradienten (Endkonzentration 250 mM Imidazol) von der Säule eluiert. FNR-haltige Fraktionen wurden basierend auf der Absorption bei 280 nm und 460 nm ausgewählt. Die FNR-haltigen Fraktionen wurden kombiniert und unter Verwendung von Amicon Ultra-4-ml-Zentrifugalfiltern (10 kDa) auf ein Endvolumen von etwa 2 ml konzentriert. Die konzentrierte FNR-Lösung wurde dann auf eine Entsalzungssäule (PD-10; GE Healthcare) aufgetragen, um das Imidazol zu entfernen. Das Enzym wurde in Einmal-Aliquots aufgetrennt, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und dann bei –80 °C gelagert.

Die Enzymkinetik wurde spektrophotometrisch anhand von Änderungen der NADPH-Konzentration bestimmt, die anhand ihrer Absorption bei 340 nm (ε = 6220 M–1 cm–1) gemessen wurde. Die Analysen wurden in 96-Well-Mikrotiterplatten mit halber Fläche (Greiner Bio-One 675001) unter Verwendung eines PHERAstar FS Microplate Reader bei 25 °C in einem Reaktionsvolumen von 100 µL durchgeführt. Dieser Assay wurde verwendet, um die Steady-State-Kinetik und die Hemmung von durch IDH1-Varianten katalysierten Reaktionen zu untersuchen. Der Testpuffer bestand aus 100 mM Tris, 10 mM MgCl2, 0,2 mM Dithiothreitol (DTT), 0,005 % (v/v) Tween 20 und 0,1 mg mL-1 Rinderserumalbumin (BSA) (pH 8,0). Für Inhibitionstests wurden IDH1-Varianten 12 Minuten lang mit einem Inhibitor inkubiert, bevor die Reaktion durch Substratzugabe gestartet wurde. Der Standardfehler wurde aus der Kurvenanpassung mit GraphPad Prism v9 abgeleitet. Einzelheiten zu bestimmten kinetischen Tests finden Sie in den Abbildungslegenden (Abb. 1–3; ergänzende Abbildung 5; ergänzende Tabelle 1).

2-Oxoglutarat (2-OG)-Dinatriumsalz, NADPH-Tetranatriumsalz (~98 %), NADP+-Dinatriumsalz, D-Isocitrat-Kaliumsalz und MgCl2 × 6 H2O stammten von Sigma-Aldrich. DL-Isocitronensäure-Trinatriumsalz stammte von ChemCruz. Die Inhibitoren stammten von MedChemExpress, BioVision, DC Chemicals, Sigma-Aldrich, Enzo Life Sciences und Cambridge Bioscience Ltd. GSK321 und GSK864 wurden freundlicherweise von GSK zur Verfügung gestellt. Stammlösungen wurden in DMSO (10 mM) hergestellt.

IDH1-Varianten wurden mithilfe von Micro Bio-Spin 6-Säulen (Bio-Rad) gemäß dem Protokoll des Herstellers in NMR-Puffer (50 mM Tris-d11, 100 mM NaCl, 10 % D2O, pH 7,5) gepuffert. Kernspinresonanzspektren (NMR) wurden mit einem Bruker AVIII 700 MHz NMR-Spektrometer erhalten, das mit einer inversen 5 mm TCI 1H/13C/15N-Kryosonde ausgestattet war. MgCl2 (10 mM), Isocitrat/2-OG und NADP+/NADPH wurden für Umsatztests hinzugefügt und der Umsatz wurde mittels 1H-NMR überwacht (NS: 16, Relaxationsverzögerung: 2 s). Das Wassersignal wurde durch Anregungsformung unterdrückt. Die Daten wurden mit Mestrenova analysiert.

IDH1-Varianten wurden in NMR-Puffer (50 mM Tris-d11, 100 mM NaCl, 10 % D2O, pH 7,5) gepuffert und unter Verwendung von Amicon Ultra Centrifugal Filters (0,5 ml, Cut-off: 50 kDa) gemäß dem Protokoll des Herstellers konzentriert. Die Experimente wurden mit 10 µM Inhibitor (aus einer 10 mM d6-DMSO-Stammlösung) durchgeführt. Die IDH1-Variante wurde in diese Lösung titriert und die PROJECT-CPMG-Sequenz angewendet40. Die experimentellen Parameter waren wie folgt: Gesamtechozeit 40 ms; Entspannungsverzögerung, 2 s. Die Wasserunterdrückung wurde durch Vorsättigung erreicht. Der Prozentsatz des Protein-Inhibitor-Komplexes ([PL]/([P] + [PL]) wurde gegen die Inhibitorkonzentration aufgetragen. Die Daten wurden mit Mestrenova analysiert und die Dissoziationskonstante wurde mithilfe der nichtlinearen Regression mit GraphPad Prism (Version 9) berechnet ).

IDH1-Varianten wurden unter Verwendung von Micro Bio-Spin 6-Säulen (Bio-Rad) gemäß dem Protokoll des Herstellers in Natriumphosphatpuffer (10 mM, pH 8,0) gepuffert. Für CD-Messungen wurde ein Chirascan-CD-Spektrometer (Applied Photophysics) verwendet, das mit einem temperaturgesteuerten Peltier-Zellenhalter ausgestattet war. Die Spektren wurden in einem Bereich von 260 bis 185 nm (0,5 nm-Intervalle) aufgenommen. Die Messungen wurden dreifach bei 23 °C durchgeführt und der Hintergrund wurde von dem der Probe abgezogen. Die Spektren wurden mit dem Savitzky-Golay-Filter (Fenstergröße 4) gemittelt und geglättet. Die Daten wurden auf die Proteinkonzentration normalisiert (gemessen mit einem NanoDrop One-Gerät) und die mittlere Restelliptizität wurde gemäß der Formel [Gl. 1]:

Um die thermische Stabilität der IDH1-Varianten zu analysieren, wurde die Wellenlänge auf 215 nm festgelegt und die Temperatur schrittweise von 10 auf 80 °C erhöht. Die Heizrate betrug 1 °C min−1 und das CD-Signal wurde alle 2 °C (±0,4 °C) gemessen. Die Spektren wurden mit dem Savitzky-Golay-Filter (Polynom 4. Ordnung, 12 Nachbarn) von GraphPad Prism (Version 9) geglättet. Die Schmelztemperatur wurde mithilfe eines Boltzmann-Sigmoidalmodells mit Graph Pad Prism (Version 9) berechnet; Der Standardfehler wurde aus der Kurvenanpassung mithilfe des Boltzmann-Sigmoidalmodells abgeleitet.

Die Messungen wurden in Tris-Puffer (50 mM, pH 7,4) mit 3 µM Protein und 3× Sypro Orange auf einem Bio-Rad Thermal Cycler CFX96 durchgeführt. Die Heizrate betrug +0,2 °C s−1 im Bereich von 20–95 °C. Die Daten wurden mit Bio-Rad CFX Manager 3.1 analysiert. Der Standardfehler wurde aus drei unabhängigen Replikaten abgeleitet.

Es wurden Novex™ WedgeWell™ 4–12 % Tris-Glycin-Gele verwendet. Die Gelkammer (Invitrogen) wurde in einem Eisbad gekühlt und die Gelelektrophorese wurde in einem Kühlraum (4 °C) unter Verwendung von NativePAGE-Laufpuffer (Invitrogen) durchgeführt. Die Gelelektrophorese wurde 1,5 h bei 160 V durchgeführt und das Gel mit InstantBlue Coomassie (Expedeon) gefärbt.

SEC-MALS-Messungen wurden mit einem Wyatt Dawn HELEOS-II 8-Winkel-Lichtstreuungsdetektor und einem Wyatt Optilab rEX Brechungsindexmonitor durchgeführt, der mit einem Shimadzu HPLC-System verbunden war, bestehend aus einer LC-20AD-Pumpe, einem SIL-20A-Autosampler und einem SPD20A UV/Vis-Detektor. Die Proben wurden mit einer Superdex 200 HR10/30-Säule mit einer Flussrate von 0,5 ml/min analysiert. Die Probenkonzentration betrug 1 mg mL−1 in einem Puffer, der Tris (20 mM, pH 7,4) und NaCl (100 mM) enthielt.

Elektrochemische Experimente wurden in einer anaeroben Glovebox (Glove Box Technology) mit Stickstoffatmosphäre (O2 < 1 ppm) durchgeführt. Die elektrochemischen Geräte (eine elektrochemische Glaszelle und rotierende pyrolytische Graphitkantenelektroden (PGE)) waren wie zuvor berichtet17. Zur Durchführung elektrochemischer Experimente wurde ein Autolab PGSTAT 10 Potentiostat mit Nova-Software verwendet. Elektrodenpotentiale (E) wurden gegen eine gesättigte Kalomelelektrode (SCE) gemessen und mithilfe einer temperaturabhängigen Potentialumwandlungsgleichung in die Standardwasserstoffelektrode (SHE) umgewandelt (bei 25 °C beträgt die Umwandlung: ESHE = ESCE + 0,241 V)17 . Die Gegenelektrode war ein Platindraht. Nanoporöse Indium-Zinn-Oxid-Elektroden (ITO) wurden durch elektrophoretische Abscheidung von ITO-Nanopartikeln (<50 nm, Sigma-Aldrich) auf Randelektroden aus pyrolytischem Graphit (ITO/PGE)17 hergestellt. Enzyme wurden auf die Elektrode geladen, indem eine gemischte Enzymlösung von 4–6 µL auf die ITO-Elektrode getropft und mindestens 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert wurde, wobei sichergestellt wurde, dass die Lösung nicht verdunstete. In allen Fällen wurden 0,85 nmol (Homodimerbasis) IDH1 (Wildtyp und alle Varianten) verwendet; Die mitbeladene FNR-Menge wurde angepasst, um das gewünschte endgültige Enzymverhältnis zu erreichen. Alle getesteten neomorphen IDH1-Varianten (R132C, R132C/S280F, R132H, R132H/S280F) wurden in einem Molverhältnis von 2,5 zu 1 mit FNR beladen (d. h. 2,5-fach mehr (Moläquivalent des Homodimers) jeder IDH1-Variante wurde im Vergleich zu FNR geladen). jedes Experiment). Im Gegensatz dazu wurden IDH1 wt und IDH1 S280F in einem Molverhältnis von 1 zu 8 mit FNR beladen, um sicherzustellen, dass das System nicht FNR-begrenzt war, da diese IDH1-Enzyme DL-Isocitrat viel schneller oxidierten als die neomorphen IDH1-Varianten. Die IDH1-Konzentrationen wurden basierend auf ihren Homodimeren berechnet. Mit Enzym beladene Elektroden wurden vor dem Eintauchen in den Reaktionspuffer für jedes Experiment gründlich mit Pufferlösung gespült, um sicherzustellen, dass sich kein freies Enzym in der Lösung befand.

IDH1-Varianten wurden mithilfe von Micro Bio-Spin 6-Säulen (Bio-Rad) gemäß dem Protokoll des Herstellers in nicht denaturierenden MS-Puffer (Ammoniumacetat, 200 mM, pH 7,5) gepuffert. Nicht denaturierende MS-Experimente wurden mit einem Quadrupol-TOF-Instrument (Waters Synapt G2Si) und einem Advion Triversa Nanomate Chip-basierten ESI-Autosampler durchgeführt. Inhibitoren wurden in MeOH gelöst und der Proteinlösung zugesetzt (endgültige Proteinkonzentration: 20 µM). Es wurde eine Sprühspannung von 1,7–1,8 kV (Sprühuntergrundgasdruck 0,6 psi, Eingangsdruck 3,7 mbar) angelegt. Die Probenkegelspannungen betrugen 100 V und 5,2 V. Die Spektren wurden mit Mass Lynx (Version 4.1) analysiert, einschließlich Zentrierung und Glättung. Der Prozentsatz des Protein-Inhibitor-Komplexes ([PL]/([P] + [PL]) wurde gegen die Inhibitorkonzentration aufgetragen. Eine Basislinienkorrektur wurde angewendet und die Dissoziationskonstante wurde mithilfe einer nichtlinearen Regression mit GraphPad Prism (Version 9) berechnet ).

IDH1 R132C/S280F (25,62 mg mL−1 in 20 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,4) wurde zur Kristallisation unter Verwendung der Dampfdiffusionsmethode mit sitzendem Tropfen verwendet. Für den Sitz-Tropfen-Aufbau wurde eine 24-Well-Cryschem-Platte (Hampton Research, USA) mit einer Reservoirlösung von 250 µL verwendet19. Ein Bildschirm, der die PEG-Konzentration (PEG3350 15–20 %, horizontale Achse in Schritten von 1 %) und die Salzkonzentration (Calciumacetat 200 oder 225 mM, vertikale Achse; jeweils beimpft bzw. nicht beimpft) und Bis-Tris (0,1 M) variiert. bei pH 7 durchgeführt. Das Enzym (25 µL) wurde 1 Stunde lang auf Eis mit 10 mM NADPH (in H2O, 10 µL), 20 mM CaCl2 (in H2O, 5 µL) und 200 mM 2-OG (in H2O, 10 µL) inkubiert, um eine Ausbeute zu ergeben eine endgültige Proteinkonzentration von 12,81 mg mL−1. Die Kristallisation wurde durch Zugabe von 2 µL der proteinhaltigen Lösung zu einer 2 µL Fällungsmittellösung erreicht. Die Platten wurden mit StarSeal Advanced Polyolefin Film (Starlab, Deutschland) versiegelt; Kristalle (durchschnittliche Größe 100 µM) zeigten sich innerhalb von 14 Tagen. Um reproduzierbar Kristalle zu erhalten, wurde das Impfen mit Zerkleinern der Kristalle unter Verwendung des SeadBeat-Kits (Hampton Research, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Kristallhaltige Tröpfchen wurden kryogeschützt, indem sie im Verhältnis 1:1 mit einer Glycerin enthaltenden Reservoirlösung (25 % (v/v)) gemischt, mit einer Nylonschlaufe geerntet und in flüssigem N2 kryogekühlt wurden. Die Kristalle wurden in flüssigem N2 gelagert, bis sie für die Datenerfassung benötigt wurden.

Die Daten wurden bei 100 K mit der Diamond Light Source (DLS) Strahllinie I24 gesammelt. Die Daten wurden mithilfe der Xia241-Strategie der automatischen Beamline-Verarbeitungspipeline indiziert, integriert und skaliert (Ergänzungstabelle 4). Die Kristallstruktur von IDH1 R132C/S280F wurde durch molekularen Ersatz (MR) unter Verwendung der AutoMR-Subroutine (PHASER42) in PHENIX43 bestimmt. Das für MR verwendete Suchmodell basierte auf IDH1 R132H (PDB: 4KZO19). Das Strukturmodell wurde durch iterative Zyklen des manuellen Neuaufbaus in COOT44 und der kristallografischen Verfeinerung in Phenix.refine45 optimiert (Details zur Verfeinerung sind in der Ergänzungstabelle 4 zusammengefasst).

Zur Kristallisation wurde IDH1 R132C/S280F (25,62 mg mL−1 in 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP), pH 7,4) verwendet. Für den Sitz-Tropfen-Aufbau wurde wie berichtet eine 24-Well-Cryschem-Platte (Hampton Research, USA) mit einer Reservoirlösung von 250 µL verwendet25. Es wurde ein Screening durchgeführt, bei dem die Ammoniumcitratkonzentration (pH 7,0, 0,75–2 M, horizontale Achse in Schritten von 0,25 M) und die DTT-Konzentration (1,5–3 mM, vertikale Achse in Schritten von 0,5 mM) variiert wurden. Das Protein (12,5 µL) wurde 1 Stunde lang auf Eis mit NADPH (10 mM; in Puffer mit 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 7,4; 5 µL), Puffer (6,8 µL) und einer 10-ml-Lösung inkubiert -facher Überschuss an DS-1001B (in DMSO, 0,7 µL) bis zu einer Endproteinkonzentration von 12,81 mg mL−1. 2 µL dieser Lösung wurden dann zu 2 µL Fällungsmittellösung gegeben. Die sitzende Tropfplatte wurde mit StarSeal Advanced Polyolefin Film (Starlab, Deutschland) versiegelt und die Kristalle erschienen nach einem Tag. Die Kristallernte wurde wie oben beschrieben mit Glycerin als Kryoschutzmittel durchgeführt.

Die Daten wurden bei 100 K unter Verwendung von Synchrotronstrahlung an der DLS-Strahllinie I03 gesammelt. Die Daten wurden mithilfe der Xia241-Strategie der automatischen Beamline-Verarbeitungspipeline indiziert, integriert und skaliert (Ergänzungstabelle 4). Eine erste MR-Lösung wurde unter Verwendung einer inhibitorgebundenen Struktur von IDH1 R132H (PDB: 5TQH31) erhalten. Aus dieser MR-Lösung wurde mit PHENIX AutoBuild45,46,47,48,49 ein Startmodell neu erstellt. Das Strukturmodell wurde durch iterative Zyklen der manuellen Neuerstellung in COOT44 und der Verfeinerung mit Phenix.refine45 optimiert (Einzelheiten sind in der Ergänzungstabelle 4 zusammengefasst). Aufgrund der begrenzten Auflösung (2,45 Å) wurden durchgehend NCS-Beschränkungen und eine TLS-Verfeinerung der B-Faktoren (16 TLS-Gruppen für die vier Ketten) verwendet.

Menschliche Glioblastom-LN18-Zellen wurden von der ATCC erhalten und gemäß den Anweisungen des Lieferanten kultiviert. LN18-Zellen wurden mithilfe lentiviraler Vektortransduktion genetisch verändert, um Transgene zu überexprimieren, die für IDH1 R132H, IDH1 R132C, IDH1 R132H/S280F oder IDH1 R132C/S280F kodieren. Zunächst wurde die IDH1 S280F-Mutantensequenz von IDH1 durch einen rekombinanten PCR-basierten Ansatz unter Verwendung der lentiviralen Transfervektoren pCC.sin.36.IDH1R132H.PPTWpre.CMV.tTA-S2tet und pCC.sin.36.IDH1R132C.PPTWpre erzeugt .CMV.tTA-S2tet50, enthält die R132H- und R132C-Sequenzen von IDH1 als Vorlagen. In dieser Reaktion wurden Primer1_forward und Primer1_reverse (Ergänzungstabelle 2) verwendet. Das mutierte IDH1 S280F-Amplikon wurde anschließend unter Verwendung von BamH1-HF und Nhe1-HF in dieselben Transfervektoren subkloniert. Anschließend wurden die Sequenzen IDH1 R132H, R132C, IDH1 R132H/S280F oder IDH1 R132C/S280F in PCR-Reaktionen unter Verwendung von Primer2_forward und Primer2_reverse (Ergänzungstabelle 2) amplifiziert und unter Verwendung von Xma1 und NheI- in den pUltra-Chili-Vektor (AddGene) kloniert. HF. Restriktionsenzyme stammten von New England Biolabs. Alle bakteriellen Transformationen wurden mit ultrakompetenten XL10-Gold-Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Alle Konstrukte wurden durch Sanger-Sequenzierung unter Verwendung von Primer3_forward und Primer3_reverse verifiziert (Ergänzungstabelle 2).

Alle IDH1-mutierten pUltra-Chili-Transferplasmide wurden durch vorübergehende Transfektion von HEK293T-Zellen zusammen mit den drei Verpackungsplasmiden pVSVg, pREV und pMDL in lentivirale Vektoren (LVs) verpackt. HEK293T-Zellen wurden in IMDM (Sigma, I3390), ergänzt mit 10 % FBS (Fisher Scientific, 11550356) und 5 % Pen-Strep-Antibiotikum (Sigma, P4458), kultiviert. 48 Stunden nach der Transfektion wurde das konditionierte HEK293T-Medium geerntet, zentrifugiert und unter Verwendung von 0,22-µm-Filtern filtriert. Die Konzentration des viralen p24-Antigens wurde mit einem HIV-1 p24-Kernprofil-Enzym-Immunosorbens-Assay (ELISA-Assay Lenti-X p24 Rapid Titer Kit) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Reihenverdünnungen von frisch geerntetem konditioniertem Medium wurden verwendet, um 1,2 × 105 LN18-Zellen in einer Platte mit sechs Vertiefungen in Gegenwart von Polybrene (8 μg ml–1) zu infizieren. Als Kontrolle wurden Zellen mit dem lentiviralen Vektor pUltra-Chili transduziert, der TdTomato, aber keine IDH1-Sequenzen enthielt.

Die RNA wurde mit dem RNeasy Micro Kit (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Bei Bedarf wurde komplementäre DNA mit dem High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) revers transkribiert. qPCR wurde verwendet, um die IDH1-Expression in Kontroll- und LV-transduzierten Zellen unter Verwendung einer IDH1-TaqMan-Sonde (Life Technologies) und des TaqMan Fast Universal PCR Master-Mix (Applied Biosystems) zu messen. Die Reaktion wurde mit dem QuantStudio™ 5 Dx Real-Time PCR System (Applied Biosystems) durchgeführt, wobei GAPDH als endogene Kontrolle diente (Life Technologies). Die Expression jedes Zielgens wurde mithilfe eines relativen Quantifizierungsansatzes (2 − ΔΔCT-Methode) bewertet.

Flüssige und steril gefilterte Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), fötales Rinderserum (FBS) nicht-US-amerikanischen Ursprungs und Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) mit 4500 mg L-1 Glucose und Natriumbicarbonat, ohne L-Glutamin, waren von Merck Life Sciences. Das Nahrungsergänzungsmittel GlutaMAXTM stammte von Thermo Fisher Scientific. Dimethylsulfoxid (DMSO) für die Molekularbiologie stammte von Merck. Sterile Spritzenfilter (15 mm Durchmesser, 0,2 µM Pore, RC-Membran) stammten von Corning. Inhibitoren wurden in DMSO auf eine Konzentration von 5 mM gelöst und vor der Verwendung mit Corning®-Spritzenfiltern (regenerierte Cellulose, 18 mm Durchmesser, 0,2 µm Poren) filtriert.

LN18-Zellen, die einen leeren Vektor enthielten oder rekombinantes IDH1 R132C, IDH1 R132C/S280F, IDH1 R132H oder IDH1 R132H/S280F produzierten, wurden bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert und in DMEM (4500 mg L−1 Glucose), ergänzt mit 10, gezüchtet % (v/v) FBS und 1 % (v/v) GlutaMAXTM. Die Zellen wurden in Platten mit 12 Vertiefungen ausgesät, mit 0,7 ml pro Vertiefung bei 200.000 Zellen ml−1. Nach 24-stündiger Inkubation wurde das ursprüngliche Medium durch frisches 0,7 ml Medium (DMEM (4500 mg L-1 Glucose), 10 % FBS und 1 % GlutaMAXTM) mit entweder 5 µM Inhibitor (Ivosidenib, GSK864, IDH224, FT-2102) ersetzt , DS-1001B) oder 0,1 % DMSO (Kontrollproben). Die Zellen wurden vor der Ernte weitere 24 Stunden lang inkubiert. Das Medium wurde während der Ernte durch Absaugen entfernt, bevor die Vertiefungen zweimal vorsichtig mit 0,7 ml PBS pro Vertiefung gewaschen wurden. In jede Vertiefung wurden 75 µL 80 %iges (v/v) wässriges Methanol gegeben und die Platte auf Trockeneis gestellt. Die Zellen wurden abgekratzt und der Inhalt jeder Vertiefung in separate Mikroröhrchen überführt.

Zellextrakte wurden 25 Minuten lang bei 14.000 g zentrifugiert. Die DNA-Konzentration (ng µL−1) der Überstände wurde mit einem ClarioStar Plus mit einer LVis-Platte (260 nm) gemessen. 2,5 µL des Überstands wurden in jede Vertiefung gegeben. Die Platte wurde vor der Messung der DNA-Konzentration mit 2,5 µL 80 % (v/v) wässrigem Methanol pro Vertiefung ausgeblendet. Der verbleibende Zellprobenüberstand wurde in Total Recovery-Fläschchen (Waters) überführt und relativ zur DNA-Konzentration verdünnt. Die Anionenaustauschchromatographie-MS-Analyse wurde wie berichtet51 unter Verwendung eines Hochdruck-Ionenchromatographiesystems Dionex ICS-5000+ durchgeführt, das mit einer kontinuierlich regenerierten Fallensäule, einem Dionex ERS 500e-Suppressor und AS11-HC (2 × 250 mm, 4 μm) ausgestattet war. Säule, alle von Dionex (Sunnyvale, CA, USA). Dies wurde über eine HESI II-Sonde, beide von Thermo Fisher, direkt an ein Q-Exactive HF-Hybrid-Quadrupol-Orbitrap-MS gekoppelt. Die Säulentemperatur betrug 30 °C und alle Proben wurden mit einer 5-µL-Teilschleifeninjektion injiziert. Die mobile Phase bestand aus wässrigen Hydroxidionen (Flussrate: 0,250 ml/min) mit folgendem Gradienten: 0 min, 0 mM; 1 Minute, 0 mM; 15 Min., 60 mM; 25 Minuten, 100 mM; 30,1 Min., 0 mM; 37 Min., 0 mM. Der Suppressor hatte eine Durchflussrate von 0,500 ml/min und wurde im externen Wassermodus verwendet. Das MS wurde im Negativionenmodus mit den folgenden Quellenparametern betrieben: Hüllgasdurchflussrate 60; Hilfsgasdurchfluss: 20; Spülgasdurchfluss, 0; Sprühspannung 3,6 kV; Kapillartemperatur, 300 °C; RF-Pegel des S-Objektivs, 70; Heiztemperatur 350 °C. Die Parameter für MS- und MS/MS-Scans waren: Mikroscans, 2; Auflösung, 7 × 104; AGC-Target, 1 × 106 Ionen; maximale IT, 250 ms; Schleifenanzahl, 10; MSX-Anzahl, 1; Isolationsfenster, 2,0 m/z; Kollisionsenergie, 35; minimales AGC-Ziel, 5 × 103 Ionen; Apex-Trigger 1–15 s; Gebührenausschluss 3–8, >8; dynamischer Ausschluss, 20,0 s. Die Retentionszeit von 2-HG wurde durch Analyse von 1 µg mL−1 Standard in 80 % (v/v) wässrigem Methanol (HPLC-Qualität, von Sigma-Aldrich) bestimmt.

Die in dieser Studie generierten kristallographischen Daten wurden in der PDB-Datenbank unter den Zugangscodes 7PJM und 7PJN hinterlegt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt. Alle zusätzlichen Informationen, die zur erneuten Analyse der in diesem Artikel berichteten Daten erforderlich sind, sind auf Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Walsby-Tickle, J. et al. Die Anionenaustauschchromatographie-Massenspektrometrie bietet eine umfassende Abdeckung der primären Stoffwechselwege und zeigt den veränderten Stoffwechsel in IDH1-Mutantenzellen auf. Komm. Biol. 3, 1–12 (2020).

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Wir danken dem Wellcome Trust (091857/7/10/7), dem Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/L000121/1, sLoLa Grant BB/J001694/2 und BB/R013829/1), dem Medical Research Council, dem Engineering and Physical Sciences Research Council und Cancer Research UK (C8717/A18245) für die Finanzierung dieser Arbeit. RR wurde vom Oxford-GSK-Crick Doctoral Program in Chemical Biology über das Interdisciplinary Bioscience DTP, BBSRC (BB/R506655/1) und GlaxoSmithKline unterstützt. ICH dankt der Bildungsstiftung von Anne Grete Eidsvig und Kjell Inge Røkke für ein Aker-Stipendium. PR dankt der Deutschen Akademie für Naturforscher Leopoldina, Deutschland, für ein Postdoktorandenstipendium. RAH ist dankbar für die Finanzierung durch den Clarendon Fund und ein Trinity College Birkett-Stipendium. Wir danken Dr. Victor Mikhailov für seine Hilfe bei nicht denaturierenden MS-Studien und Dr. David Staunton für die Durchführung der SEC-MALS-Experimente. Die HEK293T-Zellen und die lentiviralen Verpackungsvektoren pMDL, pVSVg und pREV wurden uns freundlicherweise von E.Vigna vom Candiolo Cancer Institute (IRCCS) der Universität Turin, Italien, zur Verfügung gestellt. Wir danken den Mitarbeitern von Diamond Light Source UK für die Strahlzeit und Unterstützung an den Strahllinien I03 und I24 (Vorschlag MX-23459).

James Wood und Melissa Morgan

Derzeitige Adresse: Institut für Genetik und Krebs, Universität Edinburgh, Edinburgh, Großbritannien

Martine I. Abboud

Derzeitige Adresse: Department of Natural Sciences, Libanese American University, Byblos/Beirut, Libanon

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Ingvild C. Hvinden, Patrick Rabe.

Chemistry Research Laboratory, Department of Chemistry und Ineos Oxford Institute for Antimicrobial Research, University of Oxford, 12 Mansfield, Oxford, OX1 3TA, UK

Raphael Reinbold, Ingvild C. Hvinden, Patrick Rabe, Ian J. Clifton, James SO McCullagh, Martine I. Abboud und Christopher J. Schofield

Fachbereich Chemie, Universität Oxford, Oxford, OX1 3QR, Großbritannien

Ryan A. Herold und Fraser A. Armstrong

Institut für Krebs- und Genomwissenschaften, Universität Birmingham, Birmingham, Großbritannien

Alina Finch, James Wood, Melissa Morgan und Chiara Bardella

Institut für Pharmazeutische Wissenschaften, Universität Freiburg, 79104, Freiburg, Deutschland

Maximilian Staudt

GlaxoSmithKline, Gunnels Wood Rd, Stevenage, SG1 2NY, Großbritannien

Ja, Redmond

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CJS und MIA haben die Studie entworfen. RR, MIA und MS produzierten die Proteine. RR führte UV-Absorptionstests, 1H-NMR-Studien, CD- und DSF-Studien sowie nicht denaturierende Gelanalysen durch. RR und PR führten kristallographische Studien durch. IJC unterstützte die kristallographische Datenanalyse. RR führte nicht denaturierende MS-Studien durch. RAH und FAA führten elektrochemische Experimente durch. AF, JW und MM produzierten und klonierten die mutierten IDH-Vektoren. CB und AF erzeugten die LVs und die IDH-Mutantenzellen und führten Validierungen durch. ICH und JSOM haben die Inhibitorbehandlung von Zelllinien und die Metabolomanalyse abgeschlossen. JR unterstützte Hemmungsexperimente. RR und CJS haben das Papier gemeinsam geschrieben. Alle Autoren haben die Arbeit rezensiert.

Korrespondenz mit Martine I. Abboud oder Christopher J. Schofield.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Christal Sohl und den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Reinbold, R., Hvinden, IC, Rabe, P. et al. Die Resistenz gegen den mutierten Isocitrat-Dehydrogenase-1-Inhibitor Ivosidenib kann durch alternative Dimer-Schnittstellen-Bindungsinhibitoren überwunden werden. Nat Commun 13, 4785 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32436-4

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Eingegangen: 11. April 2022

Angenommen: 25. Juli 2022

Veröffentlicht: 15. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32436-4

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Zeitschrift für Hämatologie und Onkologie (2023)

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